细胞培养污染

1. 如何预防和去除细胞培养过程中的污染

试用中心实验方法资讯采购保障中心品牌专区NSFC如何预防细胞培养的污染问题2009-10-11 00:00体外培养的细胞受到严重污染时，有时即使想尽各种办法也难以挽回。因此，防止污染，预防是关键。只有将预防措施贯穿于整个细胞培养的始终，才能将发生污染的可能性降到最小程度。一般预防可从以下几方面着手：1、从物品、用品消毒灭菌着手细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在取样检菌一周后确认无菌才能使用。同时，在无菌过滤操作中，随着滤过体积的增大，滤膜破损的可能性增加，故应选择最后过滤的液体进行检测。定期对二氧化碳培养箱进行消毒。具体操作：75%的酒精搽拭培养箱后，使用可移动的紫外灯至少消毒 30min，加入高压灭菌过的超纯水于培养箱水槽中保持湿度。也可配制300ml的饱和硫酸铜加3L灭菌超纯水混合成硫酸铜溶液加入水槽中。2、添加抗生素各种抗生素性质不同，对各种微生物的作用也不同，联合应用比单用效果好，预防性应用比污染后使用好。但反复使用抗生素会使微生物产生耐药性，且对细胞本身也有一定影响，因此为避免诱导抗药细菌，应定期更换培养系统中的抗生素，或尽可能不用抗生素处理。3、从操作者做起（1）进无菌室前要彻底洗手，按规定穿隔离衣。开始操作前要用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。（2）操作者动作要轻，安装吸管帽、打开或封闭瓶口等操作应在火焰近处并经过烧灼进行。但要注意，金属器械不能在火焰中长时间烧灼，以防退火；烧过的器械要冷却后才能使用；已吸过培养液的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管内的培养液成分如蛋白质等烧焦后会产生有害物质，吸管再用时会将其带到培养液中；胶塞、橡皮乳头及塑料的细胞培养用品过火焰是也不能时间太长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞，同时塑料细胞培养用品也会产生变形影响使用。（3）操作时尽量不要谈话，咳嗽以防止来自唾沫和呼出的气流所造成的污染。（4）使用培养液前不宜过早开瓶，开瓶后的培养液应保持斜位，避免直立，以防止下落细菌的污染。不再使用的培养液应立即封闭瓶口，培养的细胞在处理之前勿过早暴露在空气中。（5）操作完毕后应整理好工作台面，用消毒水浸泡的纱布擦拭台面。（6） 吸取培养液、细胞悬液时，应专管专用，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去，以防止污染扩大或造成培养物之间的交叉污染。4、防止细胞交叉污染所有从别处转来的或是自己所建的细胞系都要早期留有的充足的冻存储备，一旦怀疑发生交叉污染，可做细胞遗传学方面的鉴定，如发现原有的细胞遗传物发生改变，可以复苏早期冻存的细胞使用。重要细胞系（株）的传代工作应由两人独立进行。

2. 细胞培养箱污染怎么处理

1. 培养箱消毒：先用纯水擦洗，再用95的酒精擦洗，再照紫外就可以拉！注意周围环境的清洁就不会那么容易污染的拉！

2. 我的经验是在补充水时最好把水加热一下，达到培养箱的温度。

3. 这么早就养细胞了，我们这里一般是用70％的乙醇擦洗，然后再用0.1％的新洁尔灭擦洗，不放心的话再用高锰酸钾加甲醛1：1比例熏一遍。注意要是熏的话千万注意混合之后马上离开，然后密闭细胞培养室，味道很刺激的。最好在养细胞前消毒，否则，确实没地方放细胞。

4. 我们的方法比较简单，先用75%酒精擦拭内壁，通风10分钟，紫外线照射30分钟即可。

5. 我们的通常处理是先用75%的酒精擦拭内壁，然后用甲醛+高锰酸钾熏蒸一个晚上，然后通风一整天（同时打开紫外线照射）。

6. 我们是把培养箱里的板层拿出来高压一下，箱壁用75％酒精擦一遍，换用诗乐氏擦一遍，再紫外照一夜，效果很好，其他的请高手指教。

7. 熏蒸后吹一天是绝对不够的，最起码要一个星期才可以让甲醛散尽，要不细胞长不好的

8. 有的培养箱能加热内壁到90度，也有的带有紫外线功能。常规应该每周用酒精擦洗内部一次。具体的操作请参考培养箱的手册，或着咨询培养箱技术支持。使用消毒剂应小心，培养箱内有检测温度、湿度和二氧化碳浓度的传感器，腐蚀性消毒剂或有机溶剂有可能损坏某些器件，请慎用。另外，挥发性的甲醛有毒，易燃、易爆。如果在培养箱内残留甲醛的话，细胞会死光光哦（我实验室的真实故事）。总之，先看培养箱手册，再联系技术支持，方可万无一失啊。

9. 常规最好什么也不放！硫酸铜的作用是抑制细菌生长（但多数用在处理污染的孔板）。因为现在的孵箱都有抑菌功能。

10. 我们实验室的做法:把平皿高压灭菌后,在无菌操作台内加入适量的灭菌双蒸水或者生理盐水.再加少量新洁尔灭,浓度没关系.细胞养的都可以.

3. 细胞培养污染的问题

“细胞间隙有 很多在动的小东西”可能是黑胶虫，是血清里的。可以把血清放在培专养箱培养两天，用属400倍观察下是否有会动的黑黑的（但不大像杆状），如有则是黑胶虫。如果有这种情况出现就要换血清了，据说最好的是北美血清但比较贵，澳洲血清也不错的，但是我们这边实验室也有用澳洲血清也有少量黑胶虫出现，也没办法。
培养基应该不大容易出问题的，双抗一般都是用青链的，当然也有可能你的细胞原本就有污染的。支原体污染用显微镜是看不出来的。

4. 细胞培养pbs容易污染，如何

血清，无血清培养基，PBS污染怎么能看出来
1.可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性。
2.避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染。
3.避免血清组分对实验研究的影响。
4.有利于体外培养细胞的分化。
5.可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。
缺点：
1.细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。
2.成本较高。
3.针对性很强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。

5. 困惑：细胞及培养基是被细菌污染了吗

细胞培养中常见的污染情况总结如下:
1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。仔细检查一下器皿的灭菌情况，是否在高压灭菌时放气时间足够，压力足够！尤其是和储存培养液接触的移液管等物品，连续两次污染的话有可能造成储存液污染，一定要注意！下次使用前检查一下培养液是否存在浑浊的现象！可在培养液中加相应的抗生素处理
2、霉菌：培养液是清亮的，倒置显微镜下无杂质，37度孵箱培养2-3天，仍清亮，但出现絮状杂质，镜下可见呈细丝状的团状漂浮物，可看到明显的菌丝，细胞仍可生长，但时间长之后，细胞的活力状态变差，用硫酸铜溶液擦拭CO2孵箱内，再把水盘里也加上饱和量的硫酸铜。或者在培养箱的托盘加入饱和的消毒磷酸氢二钠高盐液体,可以防止霉菌污染。 CO2孵箱被霉菌污染后，可把所有细胞暂时转移，采用过氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把过氧乙酸放置在孵箱内一个小时，使其蒸汽弥漫。待过氧乙酸的气味消散后，再移入细胞。孵箱应定期清洁（2月左右），尤其在多雨的季节。 其它培养箱清洗方法是：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外灯照。
预防霉菌污染，可在培养基里加3u/ml的两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；但细胞一旦污染，很难挽救，制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补，建议舍弃该污染细胞。，将环境彻底消毒，如果所有细胞都污染，可能是系统污染，检查一下培养基和器材，如果只是个别污染，可能是操作问题，就要注意操作
3、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的用泰乐菌素，兽用支原体病的药，但可用于细胞培养，无任何不良反应。
4、黑蛟虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以增加细胞的种板密度，以提高细胞的生存率。
5、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。
真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
6、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
污染的可能原因：可能原因很多比如配液消毒问题、操作问题、环境问题等等

关于培养基的无菌状况，取培养基至培养瓶中（不加细胞），37度试培养一段时间后观察。如果没有细菌生长 就是操作的问题。
也可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状
态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
1、孵箱应定期用三氧机消毒 或者 紫外光照射，并用酒精和新洁尔灭试擦孵箱同时孵箱内的水应是三蒸水
2、超净台\取材\器材\培养液\培养瓶\操作等因素
3、超净台的风机不能过大，风机到6-8格。否则也可能能致霉菌污染
4、无菌室经甲醛熏蒸消毒后，可用同等量的氨水喷洒中和，约几小时即可进入操作。

6. 细胞培养中如何减少污染

污染是细胞培养技术中面临的主要问题。某些污染的发生往往难以察觉检测，而且污染源能长期共存于培养体系中，这类染事实上大部分被人们忽视了。

培养的细胞作为个生物体，会对培养环境以及环境中的污染物作相应的反应，造成培养细胞生物学特性的改变，而实验结果造成潜在的威胁，而且随着污染时间的长而增加。

培养环境中的物理、化学及生物因素都可能入培养环境造成污染。由于入侵的微生物在培养系中不断增殖、代谢，因此生物性的污染对细胞的害最大。随着污染微生物的不断增殖，交叉污染可能性也不断增加。此外，微生物代谢消耗大量需的养分，同时产生多种有毒的代谢产物，如酶、抗原及毒素等，进一步对细胞产生毒害作用。因此，识细胞培养污染的途径及其危害性，建立细胞培规范的操作方法及规章制度，可以有效地防止污染保证实验体系的稳定性和可靠性。

1、细胞培养基本技术

为了减少污染对细胞培养的影响，必须建立细胞冻存库。细胞冻存库应该分主细胞库（Master cell bank，MCB）和工作细胞库（Working cell bank，WCB），当需要做实验时从主细胞库中复苏细胞建立工作细胞库。每一个冻存标本都应明确记录细胞的性质、代数及有无污染。同时还应建立规范的检测程序进行菌检及细胞鉴定。

为了保证培养细胞系的完整性，必须进行详细的实验记录，应包括以下内容:细胞系的种类及来源、有无污染（如细菌，病毒，支原体）、细胞代数和倍增时间、以及选择性突变。详细的记录有利于对细胞的遗传及生理特性在常规传代培养中因突变、污染及各种原因导致的改变进行分析。经过连续传代培养的细胞与它较早代数的冻存细胞相比，随着培养时间的延长，细胞在适应环境的过程中，其生物特性已发生了改变。培养的细胞由若干生长速度及活力各异的亚群组成。随着培养时间的延长生长速，度快及活力高的细胞亚群逐渐占优势这种选择性，趋势会影响整个细胞群的生物特性。应用不同代数的细胞连续进行实验则结果会发生偏差。建立细胞冻存库就能避免这种影响通过复苏相同代数的细胞，人们就能在较为均一的条件下重复实验。

细胞培养工作需要清洁，保持良好的环境及规范的操作程序。超净工作台是细胞培养中普遍使用的无菌操作装置，它需要合理的布置及经常性的维护。超净工作台的工作原理是驱动经高效滤菌净化后的空气，通过工作台面形成气流屏障，从而阻止外界污染物的侵入并使操作过程中产生的飞沫限制在超净工作台中。因为操作过程中可能产生有毒的物质，所以采用垂直气流比水平气流安全。
当进行移液，倾倒液体的操作过程会产生飞沫并沉积在超净工作台内物体的表面。超净工作台的气流并不能阻止飞沫的产生，飞沫会随着气流的方向飘浮。超净工作台不合理的放置、不恰当的维护以及不规范的使用会破坏超净工作台气流的方向导致飞沫更广泛的沉积。酒精灯的火焰、操作者的活动、谈话、咳嗽及打喷嚏都有可能影响气流。飞沫的沉积是导致超净工作台内物品污染的主要因素造成潜在污染的进一步传播。因此为减少交叉污染的发生，应尽可能减少超净工作台内的物品。不同细胞系以及同一个实验室不同操作者所使用的培养试剂一定要分开使用，如胰酶、培养液等。否则，一个操作者的失误可能引起所有细胞发生污染。

2、细胞培养的污染

细胞培养污染是指培养环境中侵入了对细胞生存有害的成分和造成细胞变异的异物。细胞培养污染可分为以下三类：物理性、化学性及生物性。为了使细胞培养的结果更可靠，应该固定所有培养条件，并保证其重复性。

2.1物理性污染的来源、危害及预防物理性污染常常被人们所忽视或被笼统地归为化学性污染。物理性污染通过影响细胞培养体系中的生化成分，从而影响细胞的代谢。培养环境中的物理因素，如温度、放射线、振动、辐射(紫外线或荧光)会对细胞产生影响。细胞、培养液或其它培养试剂暴露于放射线、辐射或过冷过热的温度中，可以引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化、细胞生长受抑制甚至细胞死亡。通过实验室的合理设计及建立规范的操作规程，可以减少环境中物理因素对细胞的影响。孵箱应放在温度较恒定的环境中，周围不能放置能引起机械振动的设备，如离心机。培养液及培养试剂应放在固定的位置，为避免光照试剂不能放在玻璃门的冰箱中，试剂周围不能放同位素。培养液从冰箱中取出后应在室温中放置一段时间后再进行实验，以避免过冷的温度对细胞的影响。

2.2化学性污染的来源、危害及预防 培养环境中许多化学物质都可以引起细胞的污染。化学物质并不总是抑制细胞的生长，某些化学物质如激素就可促进细胞的生长。不同细胞对化学物质污染的反应是不一样的。未纯化的物质、试剂、水、血清、生长辅助因子及储存试剂的容器都可能成为化学性污染的来源。细胞培养的必需养分，如氨基酸，若浓度超过了合适的范围，也会对细胞产生毒性。同样，不同细胞系其最佳培养条件下对血清和缓冲液的要求是不一样的，在培养中应严格控制。玻璃制品清洗过程中残留的变性剂或肥皂（通常残留在瓶盖的内表面）是最常见的化学性污染。

2.2.1水水是唯一一种在凝固时膨胀的化合物。因此在选择冻存细胞的容器时应考虑到这个因素。容器因水的膨胀而发生破裂是引起试剂污染的重要原因。为了避免金属离子、有机分子、细胞内毒素等物质对水的污染，在配制液体，清洗容器时必须使用不含杂质的超纯水。需要注意的是，超纯水放置过久其纯度会下降。

在高压蒸气灭菌及蒸馏水时水经常被污染，因为高压蒸气锅及纯水机的常规维护后可能有少量的化学物质残留。为了保证水的纯度，我们应采取措施尽量避免化学物质的残留。

2.2.2血清动物血清是细胞培养中常用的天然培养基，但血清又是潜在的生物及化学污染的来源。由于血清采集于多个动物，而且不同厂商的生产工艺及质量各不相同，因此血清中许多成分的浓度存在很大的变异。血清对不同细胞的促生长能力及毒副作用取决于这些细胞的分化功能、组织来源及培养基的成分等因素。在进行一系列实验时，为了保证实验的可重复性，最好选用同一批次的血清。

2.2.3培养液、培养附加成分、试剂培养液、培养附加成分、试剂都可能成为化学性污染的来源。细胞培养使用的所有物质都应是高纯度的，并经过权威机构的鉴定，实验者本人也应对上述成分进行纯度鉴定。同时，正确配置和储存培养液及试剂也是非常重要的，应该采取标准的操作步骤，避免液体体积计算错误，混用类似化合物等错误。

2.2.4培养器皿及容器细胞培养过程中会使用到各种不同的培养器皿及容器。培养器皿的大小，构形设计可能会影响到培养中气体交换、湿度、培养液的pH值和细胞生长密度。培养器皿的工艺及灭菌过程中的差异可能对培养体系产生影响。塑料制品在生产过程中可能残留一些有毒成形剂，生产工艺的不同可能引起器皿表面附着能力的不同。储存不同物质时应选用合适的塑料或玻璃容器，因为酒精、强酸、强碱能够溶解塑料或玻璃的某些成分。

2.3生物性污染的来源、危害及预防外界的微生物如昆虫、节肢动物、原虫、霉菌、病毒、细菌、无细胞壁的微生物(通常指支原体)和其它类型的细胞都可能侵入培养环境引起污染。只要在一个开放的环境中进行培养，都难以避免发生污染。发生污染的可能性取决于操作方法、培养室的无菌环境以及实验室的规章制度。生物性污染对细胞代谢的影响，可因污染源和细胞的种类不同而表现各异。细菌、真菌或其它微生物污染的检测可以用不同培养基进行检查。支原体污染的检测需要特殊的方法。病毒污染的检测可以使用许多体内或体外实验，包括大鼠或小鼠的接种、逆转录酶分析、凝血试验、红细胞吸附试验等。

细菌和真菌的污染较易发现并及时清除，而大多数实验室对支原体的污染缺乏足够的认识。为了防止支原体及其它微生物污染的发生和传播，必须建立规范的无菌操作程序及各种规章制度。支原体归属

于柔膜体纲（Mollicutes）的支原体目，它们都具有以下共性：无细胞壁、无细胞壁主要成分———粘肽的表达。支原体与其它细菌不同之处还在于其胞膜中含有胆固醇或其它甾醇，这种特性使支原体膜更具柔顺性，对于物理因素，如压力、渗透压、脱水的抵抗力很3大。支原体直径仅有013～018μm，并且变形能力大，故能通过滤菌器。需要指出的是，只要有一个具有增殖能力的支原体就能引起培养体系的污染。一旦细胞被污染，支原体的滴度随着时间的延长而逐渐升高，最高可至每毫升10克隆。最为致命的是，即使存在很严重的支原体污染，细胞外观可无明显变化。如果继续使用这种已被支原体污染，而貌似正常的细胞做实验，将会严重影响实验结果。

7. 细胞培养污染的问题

支原体
立克次氏体污染
它们属于专性胞内寄生微生物
动物细胞培养最怕的就是这个
污染原因跟血清
种细胞
操作有关
你接入的细胞可能有它们寄生
换一下细胞试试

8. 细胞培养中出现黑点是污染吗如何处理 已解决

一旦您在细胞培养的过程中发现有黑点生成，首先，要肉眼观察培养基是否专混浊，然后，在镜下观属察培养细胞生长的状态，黑点是否游动。如果细胞被污染，微生物则会大量繁殖，培养基就会迅速变黄、变混浊。污染包括细菌污染、支原体污染等。 如果在镜下观察细胞，生长状态良好，与黑点出现前相比，没有任何变化，那么，黑点的出现可能与以下几种情况有关： （1）细胞生长过老，破碎的细胞残骸； （2）血清质量不好，反复冻融的结果； （3）配制培养基的pH值偏高，不宜细胞生长； （4）配制培养基的水质、容器不合格。可应用离心、过滤的方法去除这些黑点；

9. 细胞培养老是污染，怎么解决的呀！！！

细胞培养最关键的还是操作，如果操作规范的话，污染几率是很小的，如果在培养的时候总是有黑色点状物质，可以考虑是不是细胞碎片或者血清里的蛋白质沉淀。

细胞污染可能原因：
1.天气太热，实验者在培养和接种或者换液时出汗（有空调稍好，但是手也出汗）。
2.培养间里可能暗藏污染原。
3.注意培养箱（这点最重要），仔细检查培养箱里的隔板的下面，有可能有霉菌斑。（我以前遇到过）
4.培养基污染多数是配置过程中造成的，仔细检查配置过程用到的器具。
5.血清过期一个月，如果保存的好应该没有问题，但是保存不好，新来的血清，用一次就可能污染。血清过期和污染是否有必然的联系不好说，我们觉得联系不大。

解决办法：
1.彻底清洁培养间，显微镜室。然后，紫外灯多照射一端时间消毒空气。
2.彻底清洁培养箱：（1）每个隔板仔细清洗，火烤。（2）培养箱大换水，换成新鲜干净的蒸馏水。（3）培养箱内壁用酒精棉球或者稀过氧乙酸认真擦洗。（4）紫外灯长时间照射（一天）。
3.实验用器械消毒：注意消毒时间和压力，有必要检查压力锅和校正压力表是否准确。
4.一次性手套在打开使用前一天放入无菌间照射消毒。
5.如果用双抗，应该现用现配。
6.注意过滤器的消毒灭菌。
7.经验告诉我们过期1年内的血清，只要保存妥当，其实血清的效价是不会降低的；还有刚购买的大规格的血清收到后，避免反复冻融，血清分装的时候要无菌分装，转入无菌间，在超净台内将血清分装入50-100ml血清瓶中封口，并于-20℃保存备用。分装时注意：① 预先要将血清轻轻摇动数周、混匀；② 用吸液管吹出血清时要注意：③ 不要吹出气泡，血清很粘稠，很容易产生气泡。如果产生气泡，则在酒精灯火焰上过一下。
8.检查培养间和超净台的通风过滤网，如果脏了，需要更换。

10. 细胞培养，被污染

细胞污染？ 细胞产品专家齐氏生物建议您先搞清楚污染的原因
1）细菌（会出现培养液变混浊，pH改变，污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株丢失。）

2）真菌（可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。）

3）支原体（部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。 ）

可以从组织清洗、实验室环境灭菌、无菌操作规范等几个方向查找一下原因。