污染蛋白库

A. 如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染

如何去除RNA提取过程中的蛋白质污染

1. 提取RNA时如何去除DNA的污染的方法：

2. 注意实验室的标准化问题，注意污染的存在，同时严格按照说明书上的操作应该没有

3. 问题。发现DNA污染，用DNAse I 消化1小时，37度

4. 离心取上清的时候，一定要小心不要取到中间的膜和下面的液体。

5. 直接加NaOH溶液与提取液混合搅拌,然后离心就可以了.因为RNA可溶于NaOH溶液,而DNA不可溶,离心后的上清液就不含有DNA了。

RNA提取步骤：

1. 匀浆处理：

① 组织 将组织在液氮中磨碎，每50-100mg组织加入1ml TRIzol，用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10%。

② 单层培养细胞 直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。

③ 细胞悬液 离心收集细胞，每5-10×106 动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1ml TRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。

2. 将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。

3. 可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5. 2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。

6. 把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。

7. 2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。

8. 用75%乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。

9. 室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可。不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5%SDS，用枪头吸打几次，55-60℃放置10分钟使RNA溶解。如RNA用于酶切反应，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。

注意事项：

1. 从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800ml TRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。

2. 匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。

4. 预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：

5. 肝和脾6-10μg，肾3-4μg，骨骼肌和脑组织1-1.5μg，胎盘1-4μg，上皮细胞8-15μg，成纤维细胞5-7μg 。

B. 怎样才能把被蛋白质污染的色谱柱冲好 ，

第一你使用的什么类型的柱子。填料的性质，分析柱还是制备柱？不同的柱子和型回号冲洗方法的都答不一样
第二对于蛋白质的分析，我了解的比较多的除了C18常规的，还有体积排阻的柱子。一般蛋白质的分子量较大，所以很容易堵塞柱子，冲洗一般都起不到很好的效果，反冲是个死马当活马医的办法，但要小流速的。不建议使用。
第三、这种情况，如果有条件的话可以打开柱头进行填补维修，但一般是没有这种条件，因为这需要工具和填料。
至于具体的办法要根据不同的情况去冲洗，但我个人认为色谱柱被样品污染后很难冲洗好，就算恢复点效果，也不会支撑很长时间的。最好是使用加保护柱，如果经济条件允许的话可以直接报废掉吧，不值得浪费精力。如果经费少的，我建议买一下国产厂家的色谱柱，他们一般负责维修的。

C. 被测dna有蛋白质污染染,是什么原因

蛋白质和DNA分离不到位，或许离心没离好

D. 长满的细胞怀疑有真菌污染，可以提蛋白做WESTERN吗

Cells are full of suspected fungal contamination and can lift proteins

E. 提取得总RNA有蛋白质污染会影响反转录的CDNA的浓度吗

在做Northern等杂交实验、构建cDNA文库、获取能够编码真核生物蛋白的基因、回获得RNA病毒基因时,会用到RNA提取和RT-PCR技术. 真核答生物的基因组是DNA,为什么不直接从DNA PCR得到我们需要的基因呢?因为真核生物的基因含有大量的非编码区,称为内元（i。

F. 抽提的rna有蛋白污染影响rtpcr吗

rtpcr时提取rna的浓度和纯度要求：浓度20ng/ul以上足够了，如果用的是组织提取，浓度一般很高，可以达到几百甚至几千。如果你用的是病毒、少量细胞，浓度低一些也没有关系。纯度需要用仪器测一下。260/280理论值应该有2.0以上，260/230值1.2以上基本合格。RT-PCR：最重要的是RNA是否有明显降解，这个需要跑电泳看。一般来说28S应该比18S亮1.5-2.0倍，说明提取得不错。反转录·聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是将RNA的反转录（reversetranscription）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA，关键是确保RNA中无RNA酶和基因组DNA的污染。提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

G. [细胞株，求助]我刚从上海中科院细胞库买了细胞回来，结果发现细胞污染严重，这种细胞库是怎么投诉的啊

没办法，这是国家细胞库。虽然便宜，来源可靠，可是就是没有售后，如果出现问题，就需要自己解决。

H. 在质粒提取中如有蛋白质残留会有什么现象如何去除蛋白污染

在质粒提取中如有蛋白质残留，会出现提取的质粒不纯净的现象，加入溶液III可以去除蛋白污染。

质粒抽主要的目的是为了去除RNA，将质粒与细菌基因组DNA分开，然后去除蛋白质及其它杂质，如果去除的不够彻底或者有残留，那么得到的质粒就不会相对纯净。

蛋白质的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白质复合物的形成。虽然将中和后的体系置于 4C 一段时间，可以形成更多的该不溶复合物，从而使蛋白质残留更少，但实践证明这样做并不是必须的，除非是大量抽提。

只要加入溶液 I 后的悬浮，加入溶液 II 后的裂解及加入溶液 III 后的中和是均匀彻底的，蛋白质的残留就应该在可以满足实验要求的水平；而只有溶液的用量足够，甚至过剩，才能确保裂解和中和是彻底的。当然，试剂盒及苯酚的使用，是可以更进一步降低蛋白质的残留的。

(8)污染蛋白库扩展阅读：

质粒抽提窍门

1、加溶液II（裂解液）后，操作一定要温和，剧烈混合会导致基因组DNA污染。[4]

2、洗脱时60℃温育（Ellution Buffer）洗脱缓冲液或去离子水效果更好。

3、若质粒提取含量低，可增加菌液样或换用ArtMediaPlasmid Culture，其比LB培养基质粒得量高

4、菌体应彻底悬浮 ， 如果没有彻底悬浮菌体，则残留的菌体团块在溶液 II 加入后，变成难以完全裂解的团块。这个团块在溶液 III 加入后，会有一部分蛋白质继续存在于溶液中，成为蛋白质残留的最大根源。

5、加入溶液 II 后，混匀，体系最好能立即变得清澈。体系如果变得清澈了，马上加入溶液 III 中和。

6、中和的操作 ，在 1.5ml 离心管中加入溶液 III 后，先颠倒两次，使管底朝上，用指头弹击管底数次，再颠倒混匀。效果非常好。

I. dna蛋白质污染能不能做rrbs测序

1，蛋白质污染对样品的纯度有明显的影响，不适合RRBS测序。
2， 简化甲基化测序(Reced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利内用限制性内切酶容对基因组进行酶切，然后进行Bisulfite测序对基因组甲基化展开分析。该技术显著提高了CpG区域的测序深度，在CpG岛、启动子区域和增强子元件区域可以获得高精度的分辨率。
3，目前RRBS测序对样品测序的要求较高：
样本类型：完整无明显降解的总DNA
样本起始量（单次）：≥ 5 μg /样本。
样本浓度：≥50 ng/μL
样本纯度：O.D. 260/280为1.8~2.0
适用物种：人和小鼠
4，DNA样品里污染蛋白质会明显降低样本纯度，不适合RRBS测序。

J. 蛋白质污染会影响荧光定量pcr吗

蛋白质污染会影响荧光定量pcr
实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入版荧光基团，利权用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。
PCR(聚合酶链式反应）是利用DNA在体外摄氏95°高温时变性会变成单链，低温（经常是60°C左右）时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度（72°C左右），DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链。
恒温PCR和实时荧光定量PCR的不同，是不同在实时荧光定量PCR的系统中加入了荧光染料（SYBR Green 或Taqman 探针等等）。以SYBR Green为例，这种染料可以结合在双链的DNA上，当PCR不断进行时，每一次退火生成的双链DNA也在增加，荧光染料结合也越多，荧光也越强。在机器中有一个探测荧光的探头，可以定量检测荧光的强度，转换成数值。这样就可以实时记录反映体系中DNA的反应情况。
荧光PCR更有优势，因为荧光PCR灵敏度高于恒温PCR，同样价格也高一些。