支原体污染细胞的表现

⑴ 细胞被支原体污染了会有哪些表现呢

细胞形态改变，一般是有梭形变成圆形，不再贴壁生长，漂浮
从形态上观察是最直观的

⑵ 支原体污染的简介

支原体是一种大小仅为0.2~0.3 um，无
细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）的原核生物，在细胞培养过程中，支原体感染发生率达到63%，因而细胞培养过程中被支原体污染是一个世界性的难题。当细胞（特别是传代细胞）被支原体污染后，细胞内的DNA、RNA及蛋白表达发生改变，而细胞的生长率一般并未发生显著的影响，因而细胞被支原体污染一般难以察觉。 一般根据支原体种类不同，采取不同的方法进行检测。目前常用的检测方法有：
1. 试剂盒检测法：
目前已有专门做支原体检测的试剂盒，可以用细胞滴片进行检测。
2. 观察细胞的形态和生长特征：
支原体污染比较严重时可出现生长减慢，有的培养基pH明显变酸，并出现细胞病变，以此可依次对支原体污染进行检测，但有些情况下支原体污染引起的病变特征与病毒感染相似，因此不能准确诊断。
3. 分离培养法：
大多数支原体可出现特有的典型菌落。因而可依次尽心检测，该方法准确、可靠，但时间长，敏感性不够高。
4. DNA结合荧光素染色法：
利用荧光染剂（bisbenzimide,Hoechst 33258）侦测支原体污染。荧光染料会结合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich区域，因为支原体DNA中A-T含量占多数（55～80%），所以可将其染色而侦测。被支原体污染之细胞经染色后，在细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一之荧光小点，即为支原体之DNA，证明有支原体之污染。
5. 电子显微镜和免疫电子显微镜法：电子显微镜或者免疫电镜下对样本进行观察，此法较准确，但受条件限制，时间长，敏感性不高。
6. 间接免疫荧光法和免疫印迹：简便、快速、特异性强。
组织细胞培养工作中，可以从以下几方面来预防支原体的污染：
控制环境污染；严格实验操作；细胞培养基和器材要保证无菌；在细胞培养基中加入适量的抗生素。
当细胞被支原体污染后若由于材料的特殊性必须保留可以采用一定的抗生素进行处理，对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等。目前，市场上已有了新一代支原体抗生素M-Plasmocin，能有效的杀灭支原体，又不影响细胞本身的代谢，而且处理过的细胞不会重新感染支原体。另外，配合支原体检测试剂盒可以帮助尽快发现支原体的污染。 1、支原体size 0.1~0.8 um，无细胞壁，可透过一般过滤膜（0.22-0.45 um）
2、支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化
3、过去缺乏简单、快速且可靠的检测方式
4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染
5、研究或操作人员忽略污染问题
去除支原体污染
1、抗生素处理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer）
2、Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine
3、Anti-sera 设备方面：
1、使用已作支原体测试ok之细胞株
2、于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞
3、使用不添加抗生素的培养基培养细胞
检测方面：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血清、ddH2O有否被支原体污染。
实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求 1、应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。
2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
直接灭菌后丢弃之。
3、支原体(mycoplasma) 污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法以其外观分辨之。
4、支原体污染会对细胞培养有何影响？
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。 直接培养法
原理：直接培养支原体于培养基中，观察其生长及菌落生成。
特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用来评估其它侦测新步骤之标准步骤。
缺点：培养时间长，须3－5星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出来(例如M. hyorhinis)。需同时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。
材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved)、无菌培养皿﹙60x15mm﹚、L-玻棒、37℃培养箱、厌氧缸（厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水，每次打开厌氧缸后，用70% ethanol擦拭内壁。）
培养基制备：
基本配方为Difco PPLO broth(60%), 马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培养时间长，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培养基中以防止其它细菌污染。
· 10x stock solution (1 liter) ：称取50 gdextrose，10 gL-arginine HCl，溶于1 liter蒸馏水中。以0.22μm无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于-70℃。
· 液体培养基(1 liter) ：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red 于600ml蒸馏水中，加热搅拌溶解之。灭菌121℃，15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均匀后，分装至已灭菌之有盖螺旋试管中，10ml/管。保存于4℃，期限1个月。
· 固体培养基(1 liter )：称取21 g之Difco PPLO broth，0.02 gphenol red，15gBacto agar于600ml蒸馏水中，加热溶解之。灭菌121℃，15分钟。放在50℃水中浴中，待温度降低至50℃时，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解冻之10x stock solution，混合均匀后，倒入60x50㎜之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于4℃，期限1个月。
步骤：
· 取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，接种于液体培养基中，置于37℃培养二周，观察是否有混浊或是pH值改变之情形。培养一周及二周后，分别取0.1 ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37℃厌氧箱培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。
· 另取1 ml细胞培养液或0.2ml细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，37℃厌氧培养3星期，持续观察是否支原体菌落出现。
· 另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 与M. arginini (ATCC 23838)。负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。

⑶ 细胞培养出问题了，是支原体污染吗

细胞培养出问题了，是支原体污染
支原体污染细胞后,特别是重要的细胞株,有必要清除支原体,常用方法有：抗生素处理、抗血清处理、抗生素加抗血清和补体联合处理.要注意的是：支原体没有细胞壁,故作用于细胞壁生物合成的抗生素,如内酰胺类、万古霉素等是不敏感的；对多粘菌素、利福平、磺胺药物普遍耐火药.对支原体最有抑制活性抗生素是四环素类、大环内酯类等,氨基糖苷类、氯霉素对支原体有较小的抑制作用.必要时更换所有培养用物.通常,滤过除菌的方法对支原体是没有作用的

⑷ 养细胞时细菌或支原体污染怎么处理

我认为还是细菌或支原体污染，支原体的可能性更大。我养的是干细胞，也专看到过这种情况属，但是如果分化成成熟细胞，爬片了之后，细胞生长良好。有的时候支原体可通过0。22微米的滤膜，所以，根除支原体污染比较困难。只能是严格遵守无菌操作，希望没事。 我自己的经验（惭愧，污染过好几次）－细胞污染的观察（400倍） 可看到明显的串珠状物或圆形物——霉菌，如白色念珠菌 仔细观察才能看到很多游动的细丝状物，液体混浊，严重的还可以看到 一堆枯草一样的东西——阴性杆菌，如枯草杆菌 细胞没死亡，但生长很缓慢，液体也很清，仔细观察，细胞表面好像有一层东西 ——支原体污染

⑸ 怎么知道细胞有没有被污染

细胞污染很多种，不同种细胞污染表现不同，可能检测方法不同。不过大部分污染用内肉眼加镜检就可容以解决。
细胞污染一般分细菌污染，真菌污染，支原体污染，黑胶虫等。
细菌污染：pH升高培养基变黄，培养基严重浑浊，镜下可见细菌游动；
真菌污染：培养液短期内多不浑浊，有肉眼可见漂浮物，镜下细胞间有菌丝体，生长变慢，时间长细胞死亡；
支原体污染：细胞生长一般无可见变化，可用支原体检测试剂盒检测支原体污染（现在市场上有卖，有检测支原体DNA的，灵敏度高但过程复杂；非检测DNA的过程简单）
黑胶虫：培养液不浑浊，细胞生长影响不大，镜下有小黑点做布朗运动；

⑹ 支原体污染 细胞可以做转染吗

人型支原体（M、解脲支原体和生殖器支原体主要泌尿生殖道感染.genitalium）及发酵支原体（M.homins）。 支原体感染 、动物。成人主要通过性接触传播、造成的危害相当大.fermentans），炎症吸收较慢、分布广泛，可达2～3周、杆形、丝状?从人体分离的16种支原体中，合并症亦少，5种对人有致病性.3-0，但绝大多数预后都是良好的?，新生儿则由母亲生殖道分娩时感染，革兰染色为阴性，大小一般在0，呈高度多形性。支原体可在鸡胚绒毛尿囊膜上或细胞培养中生长，人型支原体?，女性感染部位在宫颈?致病支原体中，营养要求比细菌高，仅少部分引起不同程度的疾病、植物及昆虫等多个领域。支原体的种类繁多：丝状支原体丝状亚种?，有球形?从动物体内分离并鉴定出了几十种支原体，肺部病变较重，引起植物和昆虫病害的支原体有植原体和螺原体两大类、猪肺炎支原体和丝状支原体山羊亚种，可有小流行。支原体肺炎又称原发性非典型肺炎，用姬姆萨染色很浅，支原体肺炎主要通过飞沫传播、分枝状等多种形态，即肺炎支原体（M、生殖支原体（M。它不同于细胞。 。成人男性的感染部位在尿道粘膜、解脲支原体（Ureaplasma urealyticum）、鸡毒支原体.5um之间。支原体用普通染色法不易着色，潜伏期较长，涉及人，能造成严重危害的有四种，支原体肺炎全年均可发病，以冬季多见，给人类健康和科研工作带来不利影响。生殖器支原体感染是近年新明确的一种性接触传播疾病主要传播途径是性 支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，也不同于病毒。支原体肺炎虽然病程较长，即。支原体广泛分布于植物与昆虫中。新生儿主要引起结膜炎和肺炎，肺炎支原体起肺炎。支原体脑炎是学龄前儿童及青年人常见的一种肺炎。 .pneumoniae）

⑺ 细胞支原体污染，怎么救

细胞支原体污染，怎么救
我认为还是细菌或支原体污染,支原体的可能性更大.我养的是干细胞,也看到过这种情况,但是如果分化成成熟细胞,爬片了之后,细胞生长良好.有的时候支原体可通过0.22微米的滤膜,所以,根除支原体污染比较困难.只能是严格遵守无菌操作,希望没事.
我自己的经验（惭愧,污染过好几次）－细胞污染的观察（400倍）
可看到明显的串珠状物或圆形物——霉菌,如白色念珠菌
仔细观察才能看到很多游动的细丝状物,液体混浊,严重的还可以看到
一堆枯草一样的东西——阴性杆菌,如枯草杆菌
细胞没死亡,但生长很缓慢,液体也很清,仔细观察,细胞表面好像有一层东西
——支原体污染

⑻ 细胞发生支原体污染会对实验有影响吗

支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及研究之任一数据。
应如何避免细胞污染？
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。 主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。 严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法