降低杂菌污染
❶ 在酒精灯火焰旁操作为什么会减少杂菌污染
超净来台内的净化空气是从上面往下吹源，酒精灯它的热量可以形成对流，可以在局部形成无菌区预防微生物感染。其次，酒精灯的消毒作用也是不能忽视的：做实验时将培养瓶内的培养液或其它液体倒掉时，瓶口难免会有一些细胞，可以在酒精灯外焰上过几下，产生的高温可以消灭细胞，避免细胞交叉污染；装培养液和各种液体的瓶子口受污染的几率也是很大的，在火焰上消一下毒也能预防污染。
❷ 菌种污染原因何在怎样避免
在菌种生产过程中，常会发生杂菌污染。因此，必须高度重视，严格无菌操作，注意每个环节堵绝杂菌污染源，使菌种成品率提高。
（1）污染原因
①培养基污染。培养基的各种原料，本身不同程度地混有杂菌或杂菌孢子。如果消毒灭菌不彻底，培养5天左右，在培养基表面和内部就会同时发生杂菌。
②菌种本身污染。一级种、二级种本身不纯，污染上杂菌，突出表现在接入的菌种块周围培养基上。混有杂菌的菌种，会导致逐级扩大成批污染。
③操作污染。在一级种和二级种确认无污染的情况下，且培养基灭菌彻底，发现被转接的培养基表面（包括种块周围）出现杂菌污染时，说明是由操作带来污染。
④环境污染。培养室湿度高，消毒不彻底，或者菌种瓶棉塞潮湿等，这种污染表现在培养料表面或料内，杂菌多样性，随时间的推移污染越来越严重。
（2）防止污染措施
①讲究配料。制作原种、栽培种的培养料，其原料要新鲜；难吸水的培养料，应先用足够的水预湿充分，拌匀，及时装瓶上锅灭菌，搁置时间不宜超过5小时。
②细心装料。选用合适的菌瓶。培养料装料按不同级别菌种要求的装料量达标时，抹净瓶口，然后加棉塞，以免水分和培养料把棉塞玷污。制作母种注入培养基时要细心，切勿将培养基沾在试管口上。管口棉塞要松紧适中，过松易侵入杂菌。
③灭菌彻底。灭菌时，试管竖放，料瓶排放要留空隙，棉塞不能互相挤压。根据培养料和容器装置，确定达标的灭菌蒸汽压力（或温度）及灭菌时间。灭菌操作过程注意排出锅内冷空气，灭菌达标后放气速度要慢。
④无菌操作。灭菌后冷却至不烫手时再搬动，可减少瓶壁破裂。接种器具要保持洁净，用前要消毒。接种时每个环节都要严格按照无菌操作规程进行，防止“病从口入”。
⑤精选良种。应选无污染，菌丝生长健壮的适龄一级种和二级种。根据不同级别的菌种质量标准，应在接种前认真检查对照，若有怀疑宁弃勿用。
⑥净化环境。接种室要通风干燥，启用前清扫、消毒。菌种培养期间，每天要适当通风，当空气相对湿度大于70%时，要开吸湿机、空调机或用生石灰等降低室内湿度。
⑦定期检查。接种后5天检查1次是否有污染。污染杂菌的菌种，要及时拣出处理，并找出原因，加以防治。同时还要预防老鼠、蟑螂等带入杂菌。
❸ 食用菌杂菌与侵染病毒有什么区别食用菌制种与栽培中常见的杂菌有哪些叙述杂菌污染的原因，危害及措施
竞争性杂菌主要来是指与自食用菌争 夺营养、空间和氧气;改变培养料的p H或分泌毒素;污染菌种、培养料,导致烂料、菌丝萎缩、子实体变色、畸形、甚至腐烂等有害微生物(不包括病毒、线虫)。竞争性杂菌主要是侵染培养料,不直 接侵染菌丝体及子实体,有间接破坏作用。多为腐生性杂菌,能通过多种渠道感染,从而导致菌种制作失败和食用菌的产量下降。因此,在生产过程中,防止竞争性 杂菌污染极为重要。
❹ 容易杂菌污染怎么办
无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。
要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。
设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。
设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流人空气过滤器，在操作过程中要防止空气压力的剧变和流速的急增。
❺ 如何预防香菇杂菌污染
防止杂菌来污染，要安排自适宜温度栽培，香菇菌丝最适宜的生长温度为22℃～25℃，子实体发育的最适宜温度为15℃。菌龄以菌丝长满瓶底5天左右为最佳。菌丝要求生长均匀、粗壮、绒毛多、色泽洁白、未扭结成原基、有鲜香味，千万不能采用带杂菌的菌种。培养基所用的木屑、麦麸子等都要新鲜、无霉变，培养料含水量50%～55%。选用的塑料袋不应厚薄不匀、质劣，否则会发生“胀筒”，为防治杂菌带来不利。
灭菌必须彻底，从拌料到装筒结束时间不超过4小时。在培养基中加入0.2%～0.3%的石灰，可防止培养基发酵变质。装袋时要松紧适度，以防“胀筒”造成污染。在灭菌锅内料袋垛叠不宜过紧，保持蒸汽畅通，避免灭菌死角。料袋装锅后5小时袋内温度要达100℃，并维持3个小时，才能达到灭菌彻底。
在栽培时要避开高温、高湿和多雨天气，春、秋二季晴天上午接种最好，夏天可在清晨或夜晚接种。接种室要用酒精熏蒸灭菌，接种要快，可减少菌种在空气中的暴露时间，以防杂菌污染。脱袋后还要防高温高湿，当菌筒出现黄水时，要用喷雾器喷水清洗表面。采菇时要将菇脚采净，否则会造成腐烂，滋生杂菌
❻ 菌种衰退的原因是什么,如何区分衰退,饰变与杂菌污染
自发突变引起衰退；
衰退菌种菌丝生长凌乱，产生角变，子实体性状改变，产量质量降低。
❼ 简述培养基灭菌不彻底而导致杂菌污染的后果
灭菌不彻底的话培养基会长菌,不仅消耗了培养基,还会释放很多专代谢产物,培养基就不能用了.
把灭菌属后的培养基按灭菌锅内的不同位置，每处抽取数管(瓶)，标上记号，置25℃～30℃培养一周左右进行检查。如果培养基没有什么变化，说明灭菌效果良好；如果某一位置的培养基出现了杂菌菌落，可能是摆放的太紧，导致蒸汽不畅，或锅的结构不合理等原因所致，应根据上述情况进行改进；如果大部分或全部菌种瓶都出现杂菌，说明灭菌温度或灭菌时间不够，应提高压力或延长灭菌时间。经过几次检验都证明能彻底灭菌后，以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
经过几次检验都证明能彻底灭菌后,以后按同样条件灭菌的则不必进行检查。
❽ 单菌种的分离是消除污染杂菌的一种方法吗
在自然界里,食用菌都不是单独存在的,而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的.所谓菌种分离,就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来,通过培养,获得纯的优良菌种.菌种分母种、原种、栽培种. (一）母种的分离培养 食用菌母种的分离,可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等. 1.孢子分离法 孢子分离法,是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝,培养成菌种的方法.这种菌种生活力较强,但孢子个体之间有差异,且自然分化现象较严重,变异大,需经出菇试验才能在生产上应用. （l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子, 让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法.蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝,有结实能力,可采用此法分离生产纯菌种.单孢分离生产上较少采用,而且技术复杂,一般采用多孢分离法. （2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上,让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法.具体操作方法,有以下几种： ①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正,无病虫害、出菇均匀、高产稳产,适应性强的八九分成熟的种菇,切去大部分,菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分.在接种箱或无菌室内,把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面,漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住.培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上,静置12～20小时,菌褶上的孢子就会散落在培养皿内.形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色,蘑菇、草菇 为褐色,香菇、金针菇孢子印白色）.用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种.待孢子萌发,生成菌落时,选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养. 还可用孢子采集器收集孢子.方法是选好种菇后,按上述程序,轻轻掀开玻璃钟罩,将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上,放在培养皿正中央.随即盖好玻璃罩,用纱布将钟掌周围塞好.并在纱布上倒少许升汞或无菌水.移入 20℃左右恒温箱培养. ②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇,用接种针直接插入褶片之间,轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子,再在培养基上划线接种. ③钩悬法：取成熟菌盖的几片菌褶或一小块耳片（黑木耳、毛木耳、白木耳〕,用无菌不锈钢丝（或铁丝、棉线等其他悬挂材料）悬挂于三角瓶内的培养基的上方,勿使接触到培养基或四周瓶壁.置适宜温度下培养、转接即可. ④贴附法：按无菌操作将成熟的菌褶或耳片取一小块, 用溶化的琼脂培养基或阿拉伯胶、浆糊等贴附在配管斜面培养基正上方的试管壁上.经6～12小时的培养,待孢子落在斜面上,立即把孢子连同部分琼脂培养基移植到新的试管中培养即可. 孢子分离得到的母种、必须进一步提纯复壮,当母种定植一星期左右,菌丝布满斜面时,选择菌丝健壮、生长旺盛无老化、无感染杂茵的母种试管,进而转管扩大,一般到栽培种,转管不宜超过5次. 孢子分离得到的母种,必须通过出菇试验,鉴定为优质菌种后,才可供生产使用. 一般菌类如蘑菇、平菇、凤尾菇、香菇、冬菇和草菇等,都可用多孢分离法获得母种. 现就银耳孢子分离略述于下： 按无菌操作获取种耳后,悬挂种耳的三角瓶经12小时培养后,瓶底培养基表面就有"孢子印".取出种耳,置 20℃—25℃温箱培养2～3天,培养基表面会出现乳白色透明的糊状小菌落,就是银耳的酵母状分生孢子形成的少量银耳菌丝.此时移接入试管斜面培养基上,待长满斜面后,再移接入营养丰富,且表面比较干燥的培养基上.经30天左右,菌落长出白色菌丝. 银耳的酵母状分生孢子、菌丝只有与羽毛状菌丝的子囊菌（香灰菌丝）混合培养时,由后者帮助分解木材及其他一些纤维物质,提供营养,才能利于银耳孢子萌发,菌丝的定植和子实体的形成. 在两种菌丝交会时,先选出两种纯菌丝. 羽毛状菌丝要纯化选育,一般要选取生长迅速,爬壁力强的试管斜面或种瓶,取先端菌丝,转管移接,置25℃—28℃上培养,重复转管几次即可得到优良纯种. 银耳菌丝的特点,菌丝生长缓慢,担孢子也不易萌发.在进行两菌混合时,先取经8～IO天培养的银耳菌丝斜面,按无菌操作方法在该斜面上距银耳菌丝约0.5厘米处接入一 小块羽毛状菌丝.置25℃下培养1周即得到混合好的银耳母种. 2．组织分离培养法 利用子实体内部组织,进行无性繁殖而获得母种的简便方法,即组织分离.该法操作简便,菌丝生长发育快,品种特性易保存下来,特别是杂交育种后,优良菌株用组织分离法能使遗传特性稳定下来.常采用以下分离方法. （l）子实体分离：种菇要选朵大盖厚,柄短,八九分成熟的优良品种.切去菇两基部,在无菌箱内以0.1％的升汞水浸几分钟,再用无菌水冲洗并揩干或用75％酒精棉球擦拭菌盖与菌柄2次,进行表面消毒.接种时,只要将种菇撕开,在萌盖和菌柄交界处或菌褶处,挑取一小块组织；移接 到PDA培养基上.置25℃左右温度下培养3-5天,就可以看到组织上产生白色绒毛状菌丝,转管扩大即得到菌种.如香菇、平菇等可以用此方法. （2）菌核分离：茯苓、猪苓、雷丸等菌的子实体不易采集.而常见的是它贮藏营养的菌核.用菌核分离,同样可以获得菌种.方法是将菌核表面洗净,用酒精或升汞消毒后,切开菌核,取中间组织一小块,约黄豆大小,接种在PDA 培养基斜面上,保温培养.应注意的是,菌核是贮藏器官,大部分是多糖类物质,只含有少量的菌丝,因此挑取的组织块要大一些,如果组织块过小,则不易分出菌种. （3）菌素分离：有一部分子实体不易找到,也没有菌核,可以用菌素进行分离.如蜜环菌、假蜜环菌.其操作方法是先用酒精或升汞将菌素表面黑色皮层轻轻擦拭2～3次, 然后去掉黑色外皮层（菌鞘）,抽出白色菌髓部分；用无菌剪刀将菌髓剪一小段,接种在培养基上,保温培养,即得该菌菌种. 菌素分离要注意：因菌素比较细小,分离素也比较细小,分离时极易污染杂菌,所以要严格操作. 3．基内菌丝分离培养法 利用食用菌生育的基质作为分离材料,来得到纯菌种的一种方法,叫基内菌丝分离法. 此种分离方法是适宜只有在特定的季节才出现,而且是朝生暮死,不易采得的子实体.基内分离法与组织分离法不同之点是,干燥的菇木或耳木中的菌丝常呈休眠状态.接种后有时并不立刻恢复生长.因此,有必要保留较长的时间（约1个月）,以断定菌丝是否能成活.基内菌丝分离法又可分为,材中菌丝分离（即菇木或耳木分离法）及土中菌丝分离法等. （1）材中菌丝分离法：就是菇木或耳木分离法,为了减少杂菌的感染,菇（耳）木在分离之前,必须进行无菌处理.可以把菇（耳）水表面用酒精灯火焰轻轻烧过,以烧死霉菌的孢子,或再用0.1％的升汞水浸孢几分钟,然后用无菌水冲洗后用无菌滤纸吸干.接种块切取时应注意.接种块必须在该菌菌丝分布的范围内切取.所以,菌丝生长缓慢的种类应浅取；菌种生长快的种类可以深取.同时.还应根据菇菌的种类、木材质地、菇（耳）木粗细、发育时间的长短来确定菌丝分布的范围.然后用一把利刀进行切取.接种块应尽量小些,以减少杂菌感染机会,提离菌种的纯度.接种块移到培养基上,就应该放到适合菌丝生长的22℃～26℃ 的温室或温箱中培养,使菌丝恢复生长. （2）土中菌丝分离：食用菌种类很多,许多土生的食用菌；孢子不易萌发.组织分离也不易成功,用土中菌丝分离获得纯种的方法,叫土中菌丝分离. 土中菌丝分离时要注意,由于土中菌丝体的周围生活着多种多样的土壤微生物,因此分离时必须尽可能避开这些微生物的干扰,尽可能批取清洁菌丝素的尖端、不带杂物的菌丝接种,反复用无菌水冲洗,在培养基中加入一些抑制细菌 生长的药物,如 40微克／升的链霉素或金霉素.如发现感染细菌,可以把菌落边缘的菌丝挑出来,接种到木屑培养基中.因细菌没有分解木质素的能力,因此在木屑培养基中不易扩展；只局限于接种处.待菌丝长出感染区后,就可以再进行扩大提纯了. （3）子实体基部分离：从瓶栽、袋栽或大床栽培的子实体基部分离出新菌丝的方法,叫子实体基部分离,现以袋栽银耳为例说明： 从出耳早、出耳率离、无病虫害的栽培室中；选择生活力最强的幼耳5袋,移到气候温和,有散射光的野外场所进行后期培养,以增强菌丝体的生活力.经培养7～10天后,待子实体直径达4～5厘米时便可取回,作为分离的母体.再从中筛选最理想的一朵,用利刀割掉银耳子实体,放置于 0℃的冰箱或有敌敌畏的容器中过夜,以便杀死瓶中的害虫.然后用75％酒精或升汞擦洗耳基和袋子外边的杂质,连同接种工具、接种培养基等移进无菌室.经灭菌后,用接种刀把袋口上部约15毫米厚的老菌根挖除,并进行培养.待袋口露出白色菌丝时,用接种针挑取一块半粒米大的白色菌结体,迅速移入母种试管培养基的中央,轻轻地脱去接种针, 塞上棉塞. 为了能够获得较多的母种,一次接种量要有100—200支试管,以便从中选择.分离后应及时移入22℃—24℃恒温箱或温室中培养.由于培养基内水分较多,菌丝恢复要比耳木分离得快.经2-3天后,分离物的边缘就可看 到白色菌丝.每天要至少观察两次,以便提纯.观察、提纯方法与耳木分离法担同.经适温培养10-15天后,当接种块扭结团出现红、黄色水珠时,即可扩大原种. （二）原种和栽培种的接种培养 母种获得以后,为了满足菌种生产的需要.应选出优良、纯度高的母种进一步扩大为原种. 原种培养基一般采用棉籽壳、木屑、草类等培养基. 瓶装或袋装的原种培养基灭菌后,可送入灭过菌的接种箱内,待瓶中的培养基冷至30℃以下,可按照无菌操作程序进行接种. 菌种瓶（袋）放入培养室时,要经常进行检查,一经发现杂菌污染,立即取出.培养成的原种,菌丝体必须健壮有力,紧贴瓶壁而不干缩,颜色纯正,具有一定清香味,生活力强,扩制成栽培种时吃料快. 栽培种就是将原种进一步扩大培养成三级种,它和原种的接种及培养相同.一般香菇、平菇、冬菇、猴头、木耳、银耳的栽培种多用锯木、棉皮作培养基.蘑菇多用粪草做培养料. 栽培种要求料块不脱水干缩.菌丝体健壮有力、颜色纯正,有清香味,无老化现象,无杂菌污染,有的种许可有少量原基,接入栽培料后,发菌快,长势好,生活力强. 原种在接栽培种时,原种瓶口的一层菌丝体应挖去不用. （三）液体种的简单培养 目前,用液体深层发酵法生产菌种,具有生产量大、周期短、菌龄整齐、成本低廉、接种方便等特点,是实现食用菌工厂化生产的目标.现将液体种培育过程简述于后,供参考. 简言之就是将纯正优良的菌种,接入液体培养基（固体培养基不加凝固剂）,使菌丝繁殖形成大量小菌球,然后将这种培养基拌入木屑或棉籽皮料内,制成菌块、培养其形成子实体.还可用于制原种、栽培种. 培养液体菌种,可将培养液装入三角瓶中,约占空瓶的五分之一重量.用摇瓶机（也称摇床）来培养.摇瓶机有旋转式和往复式两种,一般多用往复式.液体培养基可用马铃薯汁（加糖）,麦芽汁配制,也可用玉米粉、豆饼粉、糖、无机盐等配制.可以混合培养基,因适用于多种食用菌和药用菌的培养,均有好效果.组分：豆饼粉2％,玉米粉1％, 葡萄糖3％,酵母粉0.5％,磷酸二氢钾0.1％,碳酸钙 0.2％, pH自然, 12℃灭菌半小时.然后接种培养. 如果生产量较大,在三角瓶的基础上,再逐级扩大种子缸,发酵罐中进行液体深层通气发酵,产生大量菌种.但由于生产中要求设备繁多,技术性强,我们还应创造条件；实现食用菌栽培的现代化. （四）菌种质量的鉴定 菌种质量鉴定最好的方法是,做出菇试验.但是时间比较长.在购置菌种时,或在菌种生产中,如何能知菌丝生长情况,快速判断菌种质量?我们介绍几种方法： 1.肉眼观察：优良菌种菌丝浓白,绒状,粗壮密集,生长整齐,速度快,香味浓厚. 2.优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字.检查时,打开瓶塞,从菌种瓶中部取出小块菌丝体,观察色泽,闻其气味,手捏料块检查其含水量,看是否符合上述要求标准. 3.显微镜检查：挑取少量菌丝,置显微镜上观察其形态,菌丝分枝,分隔情况,锁状联合,细胞膜的厚薄. 培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体,接种斜面试管培养基上,置23℃～25℃恒温中培养,经五周后检查菌种生活力.如果菌丝生长快,旺盛纯一,健壮浓厚,长且整齐,则表示菌种的生活力强. 4.分块法：在桌上放一张白纸,把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块,用手分成2块,再把2块分成4块,4块 分成8块,依次进行.优良菌种整块多,碎渣少.劣次菌整块少,碎渣多. 5.液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后,如液面出现气泡,产生"油皮"、混浊等现象,说明菌种本 身带有杂菌.如菌块上浮,或迟迟长出很薄的菌丝层,则说明菌种生活力弱.白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状,表明菌种生命力强. （五）菌种生产过程中的杂茵防治 在生产菌种时,要时刻注意杂菌污染,以防为主,一旦发生,根治很不容易.所以整个制种过程都必须在无菌条件下进行.接种箱及所有分离、接种的用具、器皿,都要进行严格的消毒灭菌.工作人员的双手要用消毒剂清洗,并穿戴消过毒的工作服、帽和口罩,动作要敏捷、准确,尽量不要讲话走动,以防空气中的杂菌感染. 分离母种时,选择出菇早、生活力强,第一潮菇是关键,因它生活力强,接种后迅速占领阵地,无杂菌侵入的机会. 被污染的菌种,原因是多方面的,一般是灭菌不彻底所致,或因接种时无菌操作不严、瓶盖不合适造成的.所以灭菌一定要彻底,最好在接种萌将培养基置25℃左右温箱中做效果检查,经2天不长杂菌,说明彻底,可以使用,接种过程中一定要严格无菌操作. 污染杂菌另一个原因可能是分离母种时感染杂菌,因种菇表面带菌,消毒不彻底,通过组织块将杂菌带入培养基. 总之,污染机会很多,要注意环境消毒,按无菌操作规程彻底灭菌,层层把关,环环抓紧,严加注意；提离菌种质量.
❾ 食用菌菌种生产中污染杂菌的原因有哪些如何控制
在正常情况下，制作原种、栽培种或栽培袋的污染率在10%以下，各个环节和操作规范者，污染率只有1%～5%。如果超出这一范围，则要及时查明原因，采取控制措施。
（1）灭菌不彻底
这一原因特点是导致的污染率高、发生早，出现污染的部位不规则——培养基上中下均可出现杂菌菌落。这类污染常在接种培养3～5天后发生。灭菌不彻底常与以下几个因素有关：
①培养基原料的性质 不同原料导热性不同、微生物基数不同，灭菌所需时间也不同。因此，灭菌时要根据培养基的性质不同来掌握灭菌时间。常用的培养基原料与灭菌时间长短的关系是：木屑＜草料＜木塞＜粪草＜谷粒（表2-1）。
表2-6 冷空气排放程度与锅内温度、压力的关系
常压灭菌要注意，砌灶时锅体与灭菌室的相对位置要合理，最好把灶内四角砌成圆形，以便灶内均衡升温，同步灭菌，灶顶砌成圆拱形，利于冷凝水沿四壁下流而不打湿棉塞。锅小、水少、火力不足，也常是灭菌不彻底的常见原因。
⑥灭菌容量和堆放方式 以蒸汽锅炉送入蒸汽的高压灭菌锅，要注意锅炉汽化量与锅体容积相匹配，自带蒸汽发生器的燃煤、燃油或电热的高压灭菌锅，以每次容量200～500瓶（750毫升）为宜，常压灭菌灶以每次容量不超过1000瓶（750毫升）为宜。容量增大，灭菌时间要适当延长。
锅内被灭菌物品的堆放形式对灭菌效果影响显著，特别是以塑料袋为容器时，这种影响更大。因为塑料袋受热后变软，如果装料不紧，叠压堆放，极易把升温前留有的间隙充满，不利于蒸汽的流通和升温，影响灭菌效果。塑料袋摆放时，应以叠放3～4层为度，不可无限叠压，锅大时要使用搁板。有条件的最好使用铁筐，装筐灭菌。
（2）封盖不严
这类污染出现在破损处。常出现在用罐头瓶作容器、以聚丙烯薄膜作盖的原种和栽培种中，用塑料袋作容器在折角处也时有发生。聚丙烯塑料经高温灭菌后比较脆，在搬运过程中，紧贴瓶口处或有折角处极易磨破，形成肉眼不易看到的沙眼，杂菌孢子侵入而导致污染。
（3）设备设施简陋引起灭菌后无菌状态的改变
本来灭菌后的菌种瓶（袋）已达无菌状态，但灭菌后的冷却和接种环境达不到洁净无菌，生产设备和生产环节分散，又往往忽略场地的大环境卫生，导致了污染。冷却过程中，随着料温的降低，瓶（袋）内气压降低，杂菌孢子随其内外气压的动态平衡向瓶（袋）内移动、定植。瓶袋外附有较多的灰尘（附着杂菌孢子），成为接种操作污染的污染源。
（4）接种物带杂菌
这类污染的特点是杂菌菌落先从菌种块上长出，杂菌的种类一致，通常成批量发生，且出现早，接种3～5天内就可肉眼鉴别。如一支被污染的母种会造成扩接后的4～6瓶原种全部污染；一瓶被污染的原种（有时肉眼难以发现）造成扩大后的30～50瓶栽培种的污染。这类污染要靠严格检查菌种质量来克服，不但使用前要认真检查，而且在培养全过程中要连续检查和观察，确保菌种纯度。
（5）接种操作污染
这类污染一般发生在接种口处，较接种物带菌和灭菌不彻底造成的污染发生晚，一般接种后7天左右出现。其污染主要是：接种室（箱）空气消毒不彻底；菌种瓶（袋）冷却时附在表面的杂菌；接种人员自身洁净度不良；违反接种操作规程等。需注意以下技术环节：
①不使棉塞打湿 灭菌码放时，棉塞切勿贴触锅壁；灭菌结束后要自然冷却，不可强制冷却；当冷却至一定程度后微开锅门，让锅内的余热把棉塞上的水汽蒸发；灭菌时，可同时灭菌一些棉塞，留接种时换下打湿的棉塞。
②洁净冷却 灭菌后的菌种瓶（袋）不能直接放在有尘土的地面上冷却。冷却室使用前可用紫外线灯和喷雾相结合进行空气消毒。
③严格消毒 接种室（箱）使用前须严格消毒；接种操作人员须在缓冲间穿戴专用衣帽（定期洗涤）；接种前要消毒双手。
④科学操作 接种前做好一切准备工作，一次接种不间断，一气呵成；接种过程要少搬动、少说话，以减少空气震动和流动；接菌室（箱）内绝对无菌的只有酒精灯火焰周围很小的范围，接种操作应尽量在这个小区内完成；拔棉塞时，不可用力直线上拔，而应旋转式缓劲拔出，避免外界空气突然进入而带入杂菌；接种室（箱）每次的接种量不宜过大；接种时，接种工具一旦触碰了非无菌物品，如种瓶外壁、操作台面等，不要再用来取种，须重新火焰灼烧灭菌。
（6）培养环境不洁或高湿
这种类型接种后污染率较低，随着培养时间的延长，污染率逐渐增高。通常大量发生在接种10天以后，甚至培养基表面已长满菌丝后，才陆续出现污染。
（7）综合控制措施
①从有信誉的科研、专业机构引进优良、可靠的原始种，做到来源清楚、性状明确、种质优良，做好出菇试验，做到使用一代、试验一代、储存一代。
②按照菌种生产各环节的要求，合理、科学地规划和设计厂区布局，配置专业设施、设备，提高专业化、标准化、规范化生产水平。
③严格按照菌种生产的工艺技术流程进行选料、配料、分装、灭菌、冷却、接种、培养和质量检测。
④严格挑选用于扩大生产的菌种，任何疑点都不可姑息，确保接种物的纯度。
⑤提高从业人员技术素质，规范操作；生产场地要定期清洁、消毒，保持大环境的整洁状态。
⑥专业菌种场要建立技术管理规章制度，确保技术的准确到位，保证生产。