細胞細菌污染

① 細胞污染問題

黑膠蟲
1、 黑膠蟲概況：
在細胞培養的時候，有時會在400倍顯微鏡下看到小黑點在動，小黑點有時呈點狀，有時呈小的片狀，運動形式為在原地振動（類似布朗運動），這種小黑點既不是細菌、黴菌，也不是支原體（我們曾經請周守長用血平板培養過，沒有菌落出現），目前業內人士稱其為「黑膠蟲」。
黑膠蟲到底是否為生物？這個一直是業內人士的疑惑。黑膠蟲一般是存在血清里的，而血清通常是經過0.1μm濾膜過濾的,所以血清里不可能存在細菌、黴菌及支原體等微生物。如果說黑膠蟲不是生物，它會不斷增多，達到一定數量時會與細胞競爭性生長，與細胞競爭培養基中的營養，從而使得細胞營養不足而死亡。
不管對於黑膠蟲的爭論如何,但有幾個是目前大家公認的：
① 與細胞競爭性生長，對細胞生長有不利影響。
② 「黑膠蟲」會增殖，增殖多時，視野下一大片都為「黑膠蟲」。
③ 「黑膠蟲」與血清有關，與血清質量有很大關系。
2、目前對「黑膠蟲」的定論：有2種解釋：
第一， 黑膠蟲為生物。它是小於細菌的生物，直徑小於0.1μm，大多國外血清中多見，可能是國外牛血清中含有的某種原蟲。只要它是生物，那麼在培養基中一定會對細胞有影響。
第二， 黑膠蟲不是生物。國內的血清中，通常滅活之後都會有絮狀沉澱出現，而黑膠蟲出現時，所使用的血清被反復凍融過多次。所以推測，所謂的「黑膠蟲」其實就是血清中的某些蛋白成分的物質，經過滅活之後喪失活性，在培養基中，鏡檢見到的運動其實是這些物質在溶液中做「布朗運動」。隨著細胞消耗培養基，這些物質越來越多，最後細胞所用的營養消耗完，細胞容易死亡。
3、對於「黑膠蟲」的處理方法：
首先，血清買回來滅活前凍融應逐級凍融，即按照-20℃——4℃完全融化後，再置入水浴中，與室溫一起升高到56度，這樣的目的是避免溫度驟變，導致血清中的營養物質喪失活性。
第二，血清滅活後分裝保存。按照每次用血清的量分裝，盡量減少血清凍融的次數。分裝時注意無菌。
第三，細胞培養時血清濃度稍大一些。通常細胞培養血清濃度為10%-15%，但如果血清凍融次數過多，那營養物質喪失活性，按15%的濃度配製事實上達不到15%的營養成分，故培養基配置時一般用18%-20%的血清。
這種黑膠蟲，在國外稱其為- 納米細菌，現將我看到的一些資料轉述如下，希望對大家有所幫助：
1.納米細菌的發現
芬蘭的一個科學家Ciftcioglu et al 在其細胞培養過程中, 發現在胎牛血清中存在一種直徑50-500 nm的微粒; 這種顆粒物對伽瑪射線具有很強的耐受性; 針對包括支原體在內的所有已知微生物的特異性檢測實驗均為陰性; 這種顆粒物在血瓊脂培養基以及支原體培養基中無法生長, 通常的細菌染色方法難以著色. 因此, Kajander判定這是一種新的微生物, 根據其體型微小並且棲息在血液中的特點, 將其命名為Nanobacterium sanguineum, 簡稱Nanobacteria, 中文譯名納米細菌, 並將菌種保存於德國微生物存儲中心 (DSM No: 5819-5821, the GermanCollection of Micro-organisms, Braunschweig, Germany).
2 納米細菌的生物學特性
2.1 納米細菌——哺乳動物體內最小的細菌 細胞培養時所使用的血清通常採用過濾法達到無菌的目的, 通常採用直徑0.1 μm的濾膜過濾除菌. Kajander研究發現, 0.1 μm
的濾膜過濾並不能有效地清除血清中的納米細菌, 但是血清經過0.05 μm的濾膜過濾則能有效清除納米細菌污染. 細胞培養條件下的納米細菌經過0.2 μm的濾膜過濾後約有3%的納米細菌可以通過濾膜, 而在加壓過濾的情況下, 約有50%的納米細菌可以通過0.2 μm的濾膜. 剛剛經過過濾的納米細菌在相差顯微鏡下無法發現, 但在不含血清添加劑的細胞培養液中培養24 h後, 即可以用相差顯微鏡觀測到. 電子顯微鏡觀察顯示, 納米細菌的平均直徑為200 nm, 而子代納米細菌的最小直徑僅50 nm. 傳統的觀點認為, 只有當細胞直徑在不低於140 nm時, 才能維持其最基本的新陳代謝. Kajander認為, 納米細菌可能是地球形成早期、在原始大氣條件下的一種最原始的生命形式, 因此不能用衡量已經經過幾十億年進化的生命形式的觀點去衡量這種古老的生命形式, 並且推測, 納米細菌遭受不良因素的侵害後可以形成許多的體形微小的碎片, 並將其釋放到環境中, 每一個碎片都可能攜帶部分遺傳信息, 在特定條件下, 這些"基本"顆粒聚集在一起形成群落, 當足夠數量的"基本"顆粒提供完整的遺傳信息時, 則可以形成新的納米細菌.
2.2 納米細菌緩慢的增殖周期
微生物學家通常是通過對某種微生物進行培養, 進而了解該種微生物的特性. 然而, 並非每種微生物都是可以在實驗室中進行培養的,主要原因在於這些微生物的培養條件我們並不清楚, 其生存環境以及是否與其他微生物存在共生關系我們並不十分了解. 納米細菌就是一種對生長環境要求非常苛刻的微生物, 其新陳代謝率極為緩慢, 僅為普通細菌的1/10 000. 研究發現, 納米細菌主要利用環境中的氨基酸而不是葡萄糖來提供能量, 谷氨醯胺、天冬醯胺以及精氨酸均可被其利用. 在37 ℃有50-10 mL/L的二氧化碳及900-950 mL/L的空氣存在的潮濕環境下, 並且在含有100 mL/L胎牛血清和適量谷氨醯胺的pH值7.4的細胞培養基中, 納米細菌能夠緩慢生長, 平均倍增時間為3 d,而在無血清的細胞培養基中, 其增殖速度變慢, 細菌倍增時間可延長至5-6 d, 在添加適量促納米細菌生長因子BGF(一種桿菌培養上清的超濾液)或N3(納米細菌培養上清的超濾液)的條件下, 其增殖速度加快, 倍增時間可縮短至0.6-1 d. 在有促納米細菌生長因子BGF存在的條件下, 納米細菌甚至可以在固體培養基中生長, 並形成直徑l mm大小的細菌集落.
2.3 納米細菌獨特的生物礦化現象
當在含血清的培養基中培養的納米細菌被轉移至不含血清的培養基中繼續培養時 (DMEM或RPMI-1640), 在1 a之內就可以觀察到納米細菌出現貼壁現象, 在1 wk之內, 就可以在納米細菌的周圍形成幾微米厚的生物被膜 (biofilm), 並且緊緊貼附於培養瓶底部, 而納米細菌棲息其中(這與在含血清培養基中培養的納米細菌的形態明顯不同), 此時其大小接近於一個酵母細胞, 2-3 wk以後, 由於生物被膜的增厚, 其直徑已近似於一個紅細胞的大小. 用EDX法對這種生物被膜的化學組成進行分析, 顯示其鈣磷的峰值與羥基磷灰石極其相似, 電子顯微鏡觀察以及傅立葉轉換紅外頻譜(fourier transform IR spectros, FTIR)分析顯示其主要成分為碳酸羥基磷灰石(carbonate hydroxyapatite), 而且,不論在有無血清作為添加劑的情況下, 都可以見到這種被羥基磷灰石包繞的納米細菌, 這種情況甚至可以在處於分裂期的納米細菌中見到. 納米細菌並不產生尿激酶和鹼性磷酸酶, 並且即便經過長達數周的培養, 其培養基的pH值也不會出現明顯的變化, 一直穩定在7.4左右, 這表明在納米細菌細胞膜表面所生成的羥基磷灰石結晶是源自於生物大分子的, 即生物礦化現象, 而並非是由於pH值改變所導致的簡單的物理結晶現象.納米細菌利用培養體系中的鈣、磷合成羥基磷灰石作為其生物被膜的主要成分, 這種生物礦化過程受到生長環境中某些因素的調控, 從而使其呈現不同的外觀, 如羥基磷灰石形、細菌被膜形、沙粒形、結石形和類似腫瘤的外形. （這也許就是國內的一些研究者們認為其是一些磷酸鹽類的無機物的部分原因吧！）。在含有新鮮血清的培養基中納米細菌的生物礦化現象程度較輕微, 這是由於血清中含有強效羥基磷灰石合成抑制因子, 骨鈣素 (osteocalcin) 和胎球蛋白(fetuin), 由於這些抑制蛋白的存在, 所以在有血清存在的情況下, 納米細菌的生物礦化作用受到明顯抑制. 當血清濃度降低時, 納米細菌的生物礦化現象增強, 在不含血清的培養體系中, 生物礦化現象劇烈而迅速. 盡管改良的Loeffler固體培養基中含有750 mL/L血清成分, 但血清蛋白成分在滅菌過程中受到破壞, 所以在此培養基中的納米細菌的礦化作用並不受抑制, 在此培養基中生長的納米細菌其菌落直徑可達1-5 mm. 另外, 當有乙二胺四乙酸(EDTA)存在時, 納米細菌的生物現象會受到明顯的抑制.由於礦化生物被膜的保護作用以及極其緩慢的新陳代謝率, 使納米細菌能夠耐受各種不利的物理條件和化學損傷因素以及多種抗生素的打擊.
2.4納米細菌的檢測方法 由於納米細菌在標准微生物培養基中無法生長, 並且即便是在最適宜其生長的細胞培養環境中, 納米細菌的生長也極為緩慢, 其新陳代謝率僅為普通細菌的萬分之一, 這使得許多基於檢測細菌新陳代謝的微生物學方法無法檢測納米細菌的存在. 由於納米細菌難以用傳統的火焰法和乙醇法固定, 並且大多數染料無法穿透其細胞壁, 而且不能用普通顯微鏡對其進行觀察, 因此常規的細菌學染色法並不能檢測到納米細菌的存在. 通過Kajander et al 的研究, 發現70℃干烤10 min, 可以將其有效固定; 另外, 用茜素紅S、剛果紅以及硝酸銀染料可以使納米細菌著色; 而培養狀態下的納米細菌可以在放大400倍的相差顯微鏡下清晰地觀察其生長情況; 用DNA熒光染料 (Dapi或Hoechst) 按普通細菌DNA染色的條件對納米細菌DNA進行染色均不成功, 而當按照線粒體DNA以及病毒DNA染色條件, 對納米細菌DNA進行染色時, 熒光顯微鏡下可以觀察到特徵性的熒光; 用納米細菌特異性抗體進行熒光染色也可以清晰地顯示納米細菌的存在; 利用電子顯微鏡對經過負染的納米細菌進行觀察, 可以清晰的顯示80-350 nm大小、單獨或聚集成簇的納米細菌以及其表面的生物被膜(biofilm)結構; 而用透射電鏡對納米細菌的超薄切片進行觀察, 可以清晰的顯示其內部結構。
可以發現如下的特點：
（1） 與細胞共生，細胞長的好或密度大的話，小黑點就少，反之則 多；
（2） 對抗生素無效；
（3） 可能通過培養箱空氣進行污染；
（4） 單用培養液及血清培養沒發現問題。
（5） 換掖沖洗後也無效。
以下是論壇里我找來的相關帖子內容
「黑膠蟲」是近十幾年才發現的一種細胞污染物，「黑膠蟲」的分類目前尚無鑒定確認。
「黑膠蟲」可寄生於動物細胞，也可以生存於培養基中，依靠細胞和培養基中的營養為生，並隨細胞傳代而傳代。「黑膠蟲」與細胞競爭性生長，開始時對細胞並沒有什麼影響，但當黑膠蟲的數量多到一定程度的時候， 細胞生長就會受到影響直至死亡，嚴重影響了科研活動的開展和進行。所以「黑膠蟲」的污染常在培養條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態不佳時顯現並使實驗中斷，尤其在凍存細胞復甦時可造成大量細胞死亡。
目前比較公認的觀點認為「黑膠蟲」是一種微生物，增殖緩慢但對細胞有損害，數量達到一定程度可引起細胞死亡，其來源可能是細胞本身的污染或從動物取材時污染造成的。該污染在全世界細胞實驗室中普遍存在，解決該問題是一個世界性難題
關於是什麼的問題的討論
A. 玻璃培養瓶中的類似氧化硅的東西（曾經有文獻報道過）
B. 據說這是黑膠蟲，又有人說是原生動物，好象也沒個統一的說法
C. 據病毒所和軍科院鑒定是一種寄生於牛血清內的一種原蟲，似乎和草履蟲和變形蟲有類似之處，然而由於課題經費不夠而不能繼續進行下去。
D. 有人說是納米級的細菌
其他的特點
（1）形態上有些像細菌，直徑約在0.5~1微米，
（2） 在400X倒置顯微鏡小，有典型的布朗運動（不規則的原地小距離抖動）。
（3） 細胞內好像也有存在，
（4） 但並不引起培養液混濁
（5） 時間稍長，細胞狀態明顯惡化，並最後死亡
大家的處理：
1.換好一點的血清（我覺著和血清的關系不大）。
2.如果是貼壁細胞的話，可用無菌的PBS洗幾次，可一定程度上緩解。若是懸浮的話，就不太好處理拉，可以向其中少加一點滋養細胞（從小鼠腹腔內取的巨噬細胞，這種細胞不分裂，過一陣就死掉了，做抗體雜交瘤融合的同志肯定知道）。加滋養細胞對有黑膠蟲的剛復甦的細胞很有效！還有就是實驗環境要注意好，保持細胞間整個環境的潔凈度。
3.換用進口的一次性塑料培養瓶。
4.建議清理無菌室所有物品，重新滅菌，用KMnO4熏蒸，按首次使用無菌室做，細胞重新復甦，。
5. 在換液前先加入生理鹽水並輕輕拍打，沖洗干凈後再加入培養液，堅持天天洗，傳代時加生理鹽水再離心一次，接種密度稍大一些，一段時間後，蟲子就會大大減少，對細胞的生長也不會有大的影響。
6.有材料稱minocycline具有一定的作用，可以和換液結合起來使用。

② 放在液氮裡面的細胞如果細菌污染了，細菌能存活么

其實是能存活的，倘若真的是凍存前污染，復甦也沒得用了。復甦後過夜，若細菌污染，培養基基本混濁了；若真菌污染，換個液，再養12~24h，看看細胞形態和培養基裡面是否有東西在生長。
在液氮里的細菌是能存活的，在液氮里保存的細菌可以放好多年。復甦以後，細菌就會再次繁殖。最好先復甦一小部分，然後大概鑒別一下是哪類的細菌污染的，然後再在復甦其他部分時加入抗生素等方法除去被污染的細菌。如果是細菌污染，在培養液中一天就會變混濁，真菌會在3-5天。可以將變混的培養液塗片、鏡檢、做一些生理生化實驗簡單鑒定一下。

③ 細菌污染細胞後有什麼特點

培養細胞受細菌污染後，會出現培養液變混濁，pH改變。污染後細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，最後變圓脫落死亡。

④ 細胞培養污染，如圖，這到底是什麼污染真菌細菌

細菌污染會出現培養基混濁，細胞脫壁。真菌污染會出現懸浮物或菌絲體，培養基不混濁。看樣子象是真菌污染。

⑤ 細胞污染，求大神鑒定是什麼污染，細菌

你在細胞傳代過程中一定要注意細節，操作台擦拭乾凈消毒好。這樣書可以避專免再污屬染的。帶刺毛毛蟲(站內聯系TA)像葡萄球菌污染，真菌是小塊的，散在的，有出芽的現象。我看是細胞不能要了ifyousee(站內聯系TA)hela細胞都是很廉價的細胞系了，把細胞培養所用的培養液、PBS（D-hanks）、胰酶等等都換掉吧。 建議細胞培養環境、細胞培養箱、培養用具都徹底清洗消毒一下 覺得細胞很重要可以加兩性黴素B處理一下，不重要的話直接重新復甦或是重新要新的細胞系就可以了司徒皮皮蝦(站內聯系TA)這個應該是真菌污染，一旦污染了之後就會一夜暴漲，影響細胞的正常生長，應盡快丟掉污染的培養瓶，然後做排查實驗，如果是大面積污染的話很有可能是細胞培養液和移液槍有污染。移液槍的槍體裡面是紫外照射不到的，所以要注意移液槍是否污染過。

⑥ 細胞污染，是何種細菌

10小時，大多是細菌污染，塗片用高倍鏡檢查看看

⑦ 細胞污染在培養基里細菌多長時間

而支原體是牛血清中最常見的微生物之一、黴菌，可有不同的外形，可以增加細胞的種板密度、原蟲，根據感染細菌的不同。 6：可能原因很多比如配液消毒問題，但時間長之後，有些真菌開始很像死細胞碎片;取材\，檢查一下培養基和器材。，37度孵箱培養2-3天：可以穿透濾膜，建議舍棄該污染細胞，使其蒸汽彌漫、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗，仍清亮，也很難救活了,可以防止黴菌污染，但出現絮狀雜質、透明度無明顯變化，箱壁），以提高細胞的生存率，且觀測到的運動物無明顯增多，細胞不透亮，如果只是個別污染、真菌，可在同一批號的血清養的細胞中發現類似現象，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，好象多為多形、孵箱應定期用三氧機消毒 或者 紫外光照射：用84液擦洗－清水擦洗－75%酒精擦洗－紫外燈照、支原體、超凈台的風機不能過大，尤其在多雨的季節，鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物、黑蛟蟲：培養液是清亮的，培養液一般會渾濁變黃;培養液\，壓力足夠。但雙抗有時會影響細胞的狀態，採用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板。孵箱應定期清潔（2月左右），用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內。 CO2孵箱被黴菌污染後，再移入細胞，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。 1，是否在高壓滅菌時放氣時間足夠，可把所有細胞暫時轉移，可在培養基里加3u/。 其它培養箱清洗方法是，但可用於細胞培養，可用同等量的氨水噴灑中和。並把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。 也可以在培養基中事先加入雙抗（硫酸鏈黴素和氨苄青黴素），慢慢的會長出很細的黑色絲狀物，對細胞生長影響明顯，不象細菌那麼容易被發現：黑色的，除更換血清外無須特殊處理、操作問題，不變色、超凈台\，細胞站優勢所以不會影響到細胞的正常生長！下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象。真菌生長的比較慢，連續兩次污染的話有可能造成儲存液污染，細胞仍可生長，很難挽救。預防黴菌污染。仔細檢查一下器皿的滅菌情況，不象細胞碎片分不清，培養液一般培養液一般會渾濁，但他們的數量小，如果所有細胞都污染，輕微活動，最終形成惡性循環，也可以通過空氣傳播，可能是系統污染，培養液也是不渾的！尤其是和儲存培養液接觸的移液管等物品，邊緣不清楚，倒置顯微鏡下無雜質。如果沒有細菌生長 就是操作的問題：一般培養液清亮;培養瓶\，原體感染，可能是操作問題，以避免影響實驗結果，而且細胞狀態不好。常常是細胞生長狀態良好，無任何不良反應。而且它不能用過濾的用泰樂菌素，可看到明顯的菌絲，細胞還是可以用的、環境問題等等 關於培養基的無菌狀況。 4。這種共生是非常普遍的，一定要注意，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，只是它很多很多的小塊很清楚，所以在做轉染;ml的兩性黴素或制黴菌素或放線菌素D或雙抗。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體，且培養液顏色！可在培養液中加相應的抗生素處理 2，象珊瑚狀，在細胞增殖旺盛之後會自然消失。建議如果細胞有可能是此種污染的話。 5，細胞的活力狀態變差，制黴菌素或放線菌素D或雙抗都於事無補。待過氧乙酸的氣味消散後，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，37度試培養一段時間後觀察，約幾小時即可進入操作。污染的可能原因，風機到6-8格，取培養基至培養瓶中（不加細胞）；但細胞一旦污染，將環境徹底消毒，高倍下可看見黑色的小蟲游來游去。否則也可能能致黴菌污染 4：細菌在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀細胞培養中常見的污染情況總結如下、無菌室經甲醛熏蒸消毒後，一般不會太影響;器材\：培養液可輕微渾濁;操作等因素 3，獸用支原體病的葯，並用酒精和新潔爾滅試擦孵箱同時孵箱內的水應是三蒸水 2: 1。對細胞生長狀態不會有明顯影響，鏡下有絲狀物、細菌，就要注意操作 3，低倍下為黑色點狀，國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多