污染蛋白庫

A. 如何去除RNA提取過程中的蛋白質污染

如何去除RNA提取過程中的蛋白質污染

1. 提取RNA時如何去除DNA的污染的方法：

2. 注意實驗室的標准化問題，注意污染的存在，同時嚴格按照說明書上的操作應該沒有

3. 問題。發現DNA污染，用DNAse I 消化1小時，37度

4. 離心取上清的時候，一定要小心不要取到中間的膜和下面的液體。

5. 直接加NaOH溶液與提取液混合攪拌,然後離心就可以了.因為RNA可溶於NaOH溶液,而DNA不可溶,離心後的上清液就不含有DNA了。

RNA提取步驟：

1. 勻漿處理：

① 組織 將組織在液氮中磨碎，每50-100mg組織加入1ml TRIzol，用勻漿儀進行勻漿處理。樣品體積不應超過TRIzol體積10%。

② 單層培養細胞 直接在培養板中加入TRIzol裂解細胞，每10cm2面積(即3.5cm直徑的培養板)加1ml，用移液器吸打幾次。TRIzol的用量應根據培養板面積而定，不取決於細胞數。TRIzol加量不足可能導致提取的RNA有DNA污染。

③ 細胞懸液 離心收集細胞，每5-10×106 動物、植物、酵母細胞或1×107細菌細胞加入1ml TRIzol，反復吸打。加TRIzol之前不要洗滌細胞以免mRNA降解。一些酵母和細菌細胞需用勻漿儀處理。

2. 將勻漿樣品在室溫（15-30℃）放置5分鍾，使核酸蛋白復合物完全分離。

3. 可選步驟：如樣品中含有較多蛋白質，脂肪，多糖或胞外物質（肌肉，植物結節部分等）可於2-8℃10000×g離心10分鍾，取上清。離心得到的沉澱中包括細胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。處理脂肪組織時，上層有大量油脂應去除。取澄清的勻漿液進行下一步操作。

4. 每使用1ml TRIzol加入0.2ml氯仿，劇烈振盪15秒，室溫放置3分鍾。

5. 2-8℃10000×g離心15分鍾。樣品分為三層：底層為黃色有機相，上層為無色水相和一個中間層。RNA主要在水相中，水相體積約為所用TRIzol試劑的60%。

6. 把水相轉移到新管中，如要分離DNA和蛋白質可保留有機相，進一步操作見後。用異丙醇沉澱水相中的RNA。每使用1ml TRIzol加入0.5ml異丙醇，室溫放置10分鍾。

7. 2-8℃10000×g離心10分鍾，離心前看不出RNA沉澱，離心後在管側和管底出現膠狀沉澱。移去上清。

8. 用75%乙醇洗滌RNA沉澱。每使用1ml TRIzol至少加1ml 75%乙醇。2-8℃不超過7500×g離心5分鍾，棄上清。

9. 室溫放置乾燥或真空抽干RNA沉澱，大約晾5-10分鍾即可。不要真空離心乾燥，過於乾燥會導致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl無RNase的水或0.5%SDS，用槍頭吸打幾次，55-60℃放置10分鍾使RNA溶解。如RNA用於酶切反應，勿使用SDS溶液。RNA也可用100%的去離子甲醯胺溶解，-70℃保存。

注意事項：

1. 從少量樣品（1-10mg組織或102-104細胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉澱。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉澱RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉澱出來，糖原濃度不高於4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應。

2. 勻漿後加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉澱可以保存於75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。

3. 分層和RNA沉澱時也可使用台式離心機，2600×g離心30-60分鍾。

4. 預期產量：1mg組織或1×106細胞提取RNA分別為：

5. 肝和脾6-10μg，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細胞8-15μg，成纖維細胞5-7μg 。

B. 怎樣才能把被蛋白質污染的色譜柱沖好 ，

第一你使用的什麼類型的柱子。填料的性質，分析柱還是制備柱？不同的柱子和型回號沖洗方法的都答不一樣
第二對於蛋白質的分析，我了解的比較多的除了C18常規的，還有體積排阻的柱子。一般蛋白質的分子量較大，所以很容易堵塞柱子，沖洗一般都起不到很好的效果，反沖是個死馬當活馬醫的辦法，但要小流速的。不建議使用。
第三、這種情況，如果有條件的話可以打開柱頭進行填補維修，但一般是沒有這種條件，因為這需要工具和填料。
至於具體的辦法要根據不同的情況去沖洗，但我個人認為色譜柱被樣品污染後很難沖洗好，就算恢復點效果，也不會支撐很長時間的。最好是使用加保護柱，如果經濟條件允許的話可以直接報廢掉吧，不值得浪費精力。如果經費少的，我建議買一下國產廠家的色譜柱，他們一般負責維修的。

C. 被測dna有蛋白質污染染,是什麼原因

蛋白質和DNA分離不到位，或許離心沒離好

D. 長滿的細胞懷疑有真菌污染，可以提蛋白做WESTERN嗎

Cells are full of suspected fungal contamination and can lift proteins

E. 提取得總RNA有蛋白質污染會影響反轉錄的CDNA的濃度嗎

在做Northern等雜交實驗、構建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、回獲得RNA病毒基因時,會用到RNA提取和RT-PCR技術. 真核答生物的基因組是DNA,為什麼不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢?因為真核生物的基因含有大量的非編碼區,稱為內元（i。

F. 抽提的rna有蛋白污染影響rtpcr嗎

rtpcr時提取rna的濃度和純度要求：濃度20ng/ul以上足夠了，如果用的是組織提取，濃度一般很高，可以達到幾百甚至幾千。如果你用的是病毒、少量細胞，濃度低一些也沒有關系。純度需要用儀器測一下。260/280理論值應該有2.0以上，260/230值1.2以上基本合格。RT-PCR：最重要的是RNA是否有明顯降解，這個需要跑電泳看。一般來說28S應該比18S亮1.5-2.0倍，說明提取得不錯。反轉錄·聚合酶鏈反應（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）是將RNA的反轉錄（reversetranscription）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用於檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。提取組織或細胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，採用Oligo（dT）或隨機引物利用反轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板經行PCR擴增，而獲得目的基因或檢測基因表達。

G. [細胞株，求助]我剛從上海中科院細胞庫買了細胞回來，結果發現細胞污染嚴重，這種細胞庫是怎麼投訴的啊

沒辦法，這是國家細胞庫。雖然便宜，來源可靠，可是就是沒有售後，如果出現問題，就需要自己解決。

H. 在質粒提取中如有蛋白質殘留會有什麼現象如何去除蛋白污染

在質粒提取中如有蛋白質殘留，會出現提取的質粒不純凈的現象，加入溶液III可以去除蛋白污染。

質粒抽主要的目的是為了去除RNA，將質粒與細菌基因組DNA分開，然後去除蛋白質及其它雜質，如果去除的不夠徹底或者有殘留，那麼得到的質粒就不會相對純凈。

蛋白質的去除，主要是靠不溶解的 K-SDS-蛋白質復合物的形成。雖然將中和後的體系置於 4C 一段時間，可以形成更多的該不溶復合物，從而使蛋白質殘留更少，但實踐證明這樣做並不是必須的，除非是大量抽提。

只要加入溶液 I 後的懸浮，加入溶液 II 後的裂解及加入溶液 III 後的中和是均勻徹底的，蛋白質的殘留就應該在可以滿足實驗要求的水平；而只有溶液的用量足夠，甚至過剩，才能確保裂解和中和是徹底的。當然，試劑盒及苯酚的使用，是可以更進一步降低蛋白質的殘留的。

(8)污染蛋白庫擴展閱讀：

質粒抽提竅門

1、加溶液II（裂解液）後，操作一定要溫和，劇烈混合會導致基因組DNA污染。[4]

2、洗脫時60℃溫育（Ellution Buffer）洗脫緩沖液或去離子水效果更好。

3、若質粒提取含量低，可增加菌液樣或換用ArtMediaPlasmid Culture，其比LB培養基質粒得量高

4、菌體應徹底懸浮 ， 如果沒有徹底懸浮菌體，則殘留的菌體團塊在溶液 II 加入後，變成難以完全裂解的團塊。這個團塊在溶液 III 加入後，會有一部分蛋白質繼續存在於溶液中，成為蛋白質殘留的最大根源。

5、加入溶液 II 後，混勻，體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了，馬上加入溶液 III 中和。

6、中和的操作 ，在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 後，先顛倒兩次，使管底朝上，用指頭彈擊管底數次，再顛倒混勻。效果非常好。

I. dna蛋白質污染能不能做rrbs測序

1，蛋白質污染對樣品的純度有明顯的影響，不適合RRBS測序。
2， 簡化甲基化測序(Reced Representation Bisulfite Sequencing,RRBS)是利內用限制性內切酶容對基因組進行酶切，然後進行Bisulfite測序對基因組甲基化展開分析。該技術顯著提高了CpG區域的測序深度，在CpG島、啟動子區域和增強子元件區域可以獲得高精度的解析度。
3，目前RRBS測序對樣品測序的要求較高：
樣本類型：完整無明顯降解的總DNA
樣本起始量（單次）：≥ 5 μg /樣本。
樣本濃度：≥50 ng/μL
樣本純度：O.D. 260/280為1.8~2.0
適用物種：人和小鼠
4，DNA樣品里污染蛋白質會明顯降低樣本純度，不適合RRBS測序。

J. 蛋白質污染會影響熒光定量pcr嗎

蛋白質污染會影響熒光定量pcr
實時熒光定量PCR技術，是指在PCR反應體系中加入版熒光基團，利權用熒光信號積累實時監測整個PCR進程，最後通過標准曲線對未知模板進行定量分析的方法。
PCR(聚合酶鏈式反應）是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈，低溫（經常是60°C左右）時引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度（72°C左右），DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。
恆溫PCR和實時熒光定量PCR的不同，是不同在實時熒光定量PCR的系統中加入了熒光染料（SYBR Green 或Taqman 探針等等）。以SYBR Green為例，這種染料可以結合在雙鏈的DNA上，當PCR不斷進行時，每一次退火生成的雙鏈DNA也在增加，熒光染料結合也越多，熒光也越強。在機器中有一個探測熒光的探頭，可以定量檢測熒光的強度，轉換成數值。這樣就可以實時記錄反映體系中DNA的反應情況。
熒光PCR更有優勢，因為熒光PCR靈敏度高於恆溫PCR，同樣價格也高一些。