大腸菌群的衛生學意義
1. 大腸菌群的食品衛生學意義
大腸菌群最初作為腸道致病菌而被用於水質檢驗，現已被我國和國外許多國家廣泛專用作食品衛生屬質量檢驗的指示菌。大腸菌群的食品衛生學意義是作為食品被糞便污染的指示菌，食品中糞便含量只要達到10-3mg/kg即可檢出大腸菌 。
2. 11. 什麼是大腸菌群，其生理特性如何檢測大腸菌群有何食品衛生學意義
大腸菌群是評價食品衛生質量的重要指標之一，目前已被廣泛應用於食品衛生檢驗工作中。大腸菌群多存在於溫血動物糞便、人類經常活動的場所以及有糞便污染的地方，大腸菌群數的高低，表明了食品及食品生產過程中受污染的程度。大腸菌群測試片（FilmplateTM Enumeration of Coliform BE211）含有選擇性培養基、大腸菌群特異性半乳糖苷酶的顯色指示劑和高分子吸水凝膠，運用專有技術，做成一次性快速檢驗產品。
下面的是我在網上搜索的時候看到的關於這個大腸菌群的檢測，印象里叫什麼方圓3方元的，好像是吧
操作方法:
1、樣品處理：取樣品25mL（g）放入含有225mL滅菌磷酸緩沖液稀釋液（或生理鹽水）的取樣罐或均質杯內，製成1:10的樣品勻液，用1mL滅菌吸管吸取1:10樣品勻液1mL，注入含有9mL稀釋液的試管內，振搖後成為1:100的樣品勻液。
2、接種：一般食品選2～3個適宜的稀釋度進行檢測，含菌量少的液體樣品（如飲用純水和礦泉水等）可直接吸取原液進行檢測。將大腸菌群測試片置於平坦實驗檯面，揭開上層膜，用無菌吸管吸取1mL樣品勻液慢慢均勻地滴加到紙片上，然後將上層膜緩慢蓋下，靜置10s左右使培養基凝固。每個稀釋度接種兩片。同時做一片空白陰性對照。
3、培養：將測試片疊在一起放回原自封袋中，並封口，透明面朝上水平置於恆溫培養箱內，堆疊片數不超過12片。培養溫度為36℃±1℃，培養15～24h。
計數原則及報告方式:
1、培養後紙片上的藍色菌落為大腸菌群菌落，選擇菌落數在15CFU～150CFU之間的紙片進行計數。
2、若兩個稀釋度的菌落數均在15CFU～150CFU之間，則取其平均菌落數乘以稀釋倍數報告之，即為每毫升（或每克）樣品中的大腸菌群菌落數。
3、如果所有稀釋度的測試片上的菌落數都小於15CFU，則計數稀釋度最低的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。
4、如果所有稀釋度的測試片上均無菌落生長，則以小於1乘以最低稀釋倍數報告之。
5、如果最高稀釋度的測試片上的菌落數大於150CFU個時，計數最高稀釋度的測試片上的平均菌落數乘以稀釋倍數報告之。計數菌落數大於150CFU的測試片時，也可計數一個或兩個具有代表性的方格內的菌落數，換算成單個方格內的菌落數後乘以20(紙片生長面積為20cm2)即為測試片上估算的菌落數。報告單位以CFU/mL（或CFU/g）表示。
3. 什麼是大腸菌群大腸菌群的表示方法及其食品衛生學意義是什麼
大腸菌群指的是具有某些特性的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在回生化及血清學方面並答非完全一致，其定義為：需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。一般認為該菌群細菌可包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。
大腸菌群的表示方法：如果是用多管發酵法進行試驗最後用泊松分布進行統計的話，單位應該是用MPN來計量，但是如果是用平板計數法的話就是用CFU來表示的。
大腸菌群是作為糞便污染指標菌提出來的，主要是以該菌群的檢出情況來表示食品中有否糞便污染。大腸菌群數的高低，表明了糞便污染的程度，也反映了對人體健康危害性的大小。糞便是人類腸道排泄物，其中有健康人糞便，也有腸道患者或帶菌者的糞便，所以糞便內除一般正常細菌外，同時也會有一些腸道致病菌存在（如沙門氏菌、志賀氏菌等），因而食品中有糞便污染，則可以推測該食品中存在著腸道致病菌污染的可能性，潛伏著食物中毒和流行病的威脅，必須看作對人體健康具有潛在的危險性。
4. 室外家庭小型游泳池的最小尺寸 長-寬-深
尺寸沒有標準的，可以根據自己喜好來建的。
建議尺寸：
長度：如果有條件的話可以建長一點，如果不行可以加一套泳池逆流沖浪器，可以滿足泳池不夠長，（就是有一個大噴頭噴水，跟跑步機原理差不多）。
寬度：建議在2.5米以上，一個標准泳道為2.5米，寬一點更好。
深度：看個人喜好，標准泳池深度2.3米，一般游泳館深度為淺水區1.2-1.4米，深水區1.6- 2.0米。
(4)大腸菌群的衛生學意義擴展閱讀：
國內家庭游泳池分類主要有土建式游泳池、支架式游泳池和充氣式游泳池。
土建游泳池是最基本的構架，投資大，開挖土地長期佔地，專人維護，明顯是高消費的產品，很難滿足普通民眾想在家裡游泳戲水的願望。
寧波奧蘭多家庭支架游泳池。支架式家庭游泳池產品具有性價比高、拆裝簡便、不用土建、不長期佔地、壽命超長、維護簡便等優點，成年人游泳、兒童戲水均可，支架式家庭游泳池是用支架撐起泳池，裝水就可以使用。不用後，把支架取出就可以折疊收納，非常方便。
支架式家庭游泳池的材料有一定厚度，不容易破損。
充氣式家庭游泳池由多層氣囊充氣組成，用前需要用打氣筒逐一打氣裝水使用，但是此產品面對的群是嬰幼兒及兒童年齡階段的人群，又滿足不了成年人游泳的願望。
5. 有誰知道食品中大腸菌群最近似數測定的衛生學意義謝謝(*^__^*)
一、對控制腸道傳染病抄的發生與流行有利。
二、判斷食品之中是不是受到糞便污染。
三、這也反應了食品在生產、加工、運輸以及儲存等過程中的衛生情況。
(5)大腸菌群的衛生學意義擴展閱讀：
據了解，大腸菌群是國內外通用的食品污染常用指示菌之一。食品中檢出大腸菌群，表示被致病菌（比如致病性大腸桿菌、志賀氏菌、沙門氏菌）污染的可能性較大。
大腸菌群超標大概是因為產品的包裝材料、加工原料受污染，或者在生產過程中產品受到人員、工器具等生產設備、環境的污染，或者有滅菌工藝的產品滅菌不完全而引起。
6. 大腸桿菌的檢驗意義和三涼食品的檢驗意義
修改:
相關網站:http://www.foodmate.net/
我給你提供一些大腸桿菌的資料,比較亂,自己去整理.
三涼食品這個術語沒有聽說過,如果可以解釋一下,或許我會知道.
大腸桿菌O157: H7實驗 診斷研究進展
大腸桿菌O157: H7感染臨床表現
出血性腸炎：鮮血樣便，腹部痙攣性疼痛，低熱或不發熱。
溶血性尿毒綜合征（HUS）：主要發生在兒童，常出現在腹瀉後數天或1-2周。病死率一般在10%，各別可高達50%。
血栓性血小板減少性紫癜（TTP）：主要發生在成年人，尤其老年人。病人主要表現為發熱、血小板減少、溶血性貧血、腎功能異常等症狀，病情發展迅速，病死率高，有時可出現70%的病人死亡。
大腸桿菌O157: H7傳染源和傳播途經
大腸桿菌O157: H7基本上是一種食源性病原菌，可通過食用大腸桿菌O157: H7污染的牛肉、牛奶、牛肉或製品、雞肉、蔬菜、水果、飲料、水等感染,也可通過人與人、人與動物密切接觸傳播。
在實驗室，大腸桿菌O157: H7可以感染小鼠、雞、兔、豬、牛等動物。
大腸桿菌O157: H7的感染已成為世界性的問題
我國情況也不容樂觀
一、細菌培養與鑒定
1．分離培養
早期培養對確定病原有重要意義。
培養的對象首先是急性血性腹瀉患者，其次是HUS、TTP等住院病人，再其次是高危接觸者。
培養基：
山梨醇麥康凱瓊脂、胰腖大豆瓊脂
改良的伊紅美蘭 、改良的SD-39（MSD）瓊脂
添加了頭孢克肟 和 亞碲酸鉀的山梨醇麥康凱瓊脂（TC-SMAC）
添加了頭孢克肟和鼠李糖（0.5%)的山梨醇麥康凱瓊脂（CR-SMAC）
「科瑪嘉」大腸桿菌O157: H7顯色培養基
四溴熒光亞甲基蘭瓊脂
H7抗血清—山梨醇發酵培養基
增菌液：
含10mg/L 新生黴素的EB肉湯或腸道增菌液
含10mg/L 新生黴素或10mg/L鹽酸-吖啶黃的胰蛋白腖大豆肉湯
新生黴素MEC肉湯
月桂基胰蛋白腖肉湯
加入下例任何一種抑制劑均可增加培養基的選擇性
頭孢克肟 0.05mg/L 亞碲酸鉀2.5mg/L
新生黴素10mg/L 萬古黴素40mg/L
2．免疫磁珠分離法
免疫磁珠分離法是將特異性抗體吸附於一種能被吸附的磁性珠子上,然後利用抗原抗體反應特性將樣品中的大腸桿菌O157: H7富集起來。
方法:1.增菌;2.取樣品1ml加大腸桿菌O157: H7免疫磁珠20ul;3.輕輕混合10分鍾;4.將試管插入磁架上;5.吸取上清;6.加PBS,重復3-5過程;7.取管壁沉澱物,劃線接種於CT-山梨醇麥康凱瓊脂(C-頭孢克肟,T-亞碲酸鉀)等選擇性培養基。37℃培養6-24小時，挑取可疑菌落進行鑒定。
Chapman等 共檢測大便標本690份, 免疫磁珠分離法檢出25 。用免疫磁珠分離法分離的l2株大腸桿菌O157: H7中,直接培養陽性僅5株。
Wright等將接種大腸桿菌O157: H7的碎牛肉標本置加有萬古黴素和頭孢克肟的緩沖蛋白腖水培養,然後直接或用大腸桿菌O157抗體包被的磁珠分離細菌後,接種於CT-SMAC,結果直接次培養檢出量為200cfu/g,而免疫磁珠分離法僅需 2cfu/g 。
Chapman等先用EC肉湯增菌,然後用免疫磁珠分離法富集牛糞便大腸桿菌O157: H7菌株,再用選擇性培養基分離，並與CR-SMAC和CT-MAC直接培養作比較。用前者檢測接種12株不同大腸桿菌O157: H7菌株的牛糞便懸液,其敏感性比在兩種培養基上直接培養高100倍。
Cubbon等用免疫磁分離法（IMS）檢測牛糞便和食品標本的大腸桿菌O157: H7。在一起經牛奶傳播的大腸桿菌O157: H7爆發中,用IMS、糞便培養和多聚酶鏈反應(PCR)檢測Vero毒素基因的攜帶,用三種方法對糞便大腸桿菌O157: H7的分離率作比較結果,在受檢的142份糞便標本中,直接培養和IMS均陽性20 份,另13份僅IMS陽性。因此,IMS提高了大腸桿菌O157: H7感染病例的檢出率,與PCR符合率高。
目前，污染的肉、家畜，甚至飲用水均面臨大腸桿菌O157: H7的衛生威脅。檢測食品和水源中腸道病原體使用傳統的培養法,結果不理想。IMS和其它檢測的研究表明,對快速檢測食品和環境標本似乎前景良好,Yu檢等以IMS結合電化學發光檢測法(ECL)檢測食品和污染物中的大腸桿菌。結果顯示,在原緩沖液檢出大腸腸菌的范固為100－1000 cfu/lm,在食品檢出的范圍為1000－2000cfu/lm ，檢測時間十分快,一般不到1小時。菌O157: H7菌株的牛糞便懸液,其敏感性比在兩種培養基上直接培養高100倍。在監測牛群的4個月間,從牛採集1024份直腸標本,其中檢出大腸桿菌O157: H784份（8.2%）84份中有23份（27.4%）由直接培養和IMS分離。23份中15份由兩種培養基、5份僅由CT-SMAC、3份僅由CR－SMAC分離,其餘61份(72.6%)僅IMS分離。用含吐溫－20 的PBS洗滌磁珠可減少其它微生物與磁珠的非特異性結合。用無關的抗體包被磁,則大腸桿菌O157: H7不結合。IMS具有快速、操作簡單、特異性高,在流行病學調查中有價值。
3．生化反應
目前許多國家使用的O157和 H7特異性抗體與極少數細菌具有不同程度交叉反應。因此用生化試驗確定為大腸桿菌是必須的。
典型大腸桿菌的主要生化反應結果如下：
動力試驗（+） 葡萄糖（+） 麥芽糖（+）甘露醇（+） 蔗糖（－/+） 硫化氫（－） 尿素（－） 靛基質（+） 甲基紅（+） V-P試驗（－）枸櫞酸鹽（－）苯丙氨酸脫羧酶（－）賴氨酸脫羧酶（+/－）鳥氨酸脫羧酶（ +/ －）氧化酶（－）氰化鉀（－）
與O157有鑒別意義的生化反應見表1。
MUG即4-甲基傘形化內酯-β-葡萄糖醛酸苷。大多數大腸桿菌具有葡萄糖醛酸酶,可水解MUG產生熒光, 但O157: H7中大多數菌株則不水解MUG。Thompson等建立了一種快速MUG試驗,取 MUG試劑0.5ml置試管中,以無菌棉簽挑取待檢菌純培養物混勻於其中,44.5℃置20min,暗室內高強度光源下觀察結果,產生藍色熒光者為陽性。
二．血清學檢測
1．玻片凝集試驗
2. 膠體金免疫技術
3. ELISA
4．免疫熒光技術
5．膠乳凝集
6. 間接血凝分析(IEHA)
7. 全自動抗原抗體檢測系統
8. 免疫印記法
1．玻片凝集試驗
玻片凝集試驗是鑒定O抗原最經典的方法,實驗中如果凝集反應不明確，但根據臨床表現和生化反應等菌株高度可疑時,可100℃加熱菌液30min再行玻片凝集試驗。這樣可去除K抗原的影響。為排除交叉反應引起的凝集造成假陽性,應繼而做試管凝集反應,所測得的效價不應低於診斷血清原標定效價的一半。鑒定H抗原也應同時做玻片和試管凝集試驗,並應先對待檢菌做動力試驗,在動力活潑時取培養物做H抗原鑒定。
2. 膠體金免疫技術
膠體金免疫技術特點是以膠體金作為標記物進行的抗原抗體反應。這一技術最初用於免疫電鏡技術。至今，在免疫測定中，金標記常與膜載體配合，形成特定模式，典型的如斑點免疫滲濾試驗和斑點免疫層析試驗等，已是目前應用廣泛的一種簡便、快速的血清學檢驗方法。
膠體金的制備多採用還原法，氯金酸是主要還原材料。金顆粒的大小取決於制備時加入的檸檬酸三鈉的量。
膠體金免疫層析試驗時以硝酸纖維膜為載體，利用了微孔膜的毛細管作用，滴加在膜條一端的液體慢慢向另一端滲移，猶如層析一樣。
中國預防醫學科學院微生物研究所利用膠體金技術、雙抗體夾心法和顯色反應等特點，研製了大腸桿菌O157: H7病原體快檢金卡，通用於定性檢測糞便、食品、水等樣品中的O157: H7大腸桿菌。顯色程度與樣品中細菌含量成正比，最低測菌量為少於100個菌細胞，主要特點是敏感性高，可用於待檢樣品初篩，陽性樣品可進行細菌分離，減少工作量。
3. ELISA
大腸桿菌O157: H7的常用檢測方法是糞便培養後作細菌分離,然後用生物化學和免疫學方法鑒定,一般需72 小時。
Dylla等用一種快速ELISA直接檢測糞便中大腸桿菌O157: H7,並與標准培養方法加以對照。結果顯示,ELISA檢測183份糞便標本,檢出大腸桿菌O157: H7 9份。常規培養法陰性176份,而ELISA陰性174份。總特異性為98.9%。該法與其它非O157: H7大腸桿菌無交叉反應,是一種准確、敏感、特異、易觀察結果的篩選方法，尤其適用於中、小實驗室及大量糞便標本的流行病學調查。
Padhye等用單克隆抗體進行直接ELISA反應檢測O157: H7,除O26 ：H11外，未發現與沙門氏菌、結腸炎耶氏森菌、志賀氏菌和肺炎克雷伯民菌等有交叉反應。單克隆抗體用於檢測大腸桿菌O157: H7有明顯特異性，可作為一種免疫試劑用於臨床和食物標本的快速檢測。Clark 等近一步對單克隆抗體的研究發現,此種單克隆抗體識別的物質是LPS,這種LPS抗原決定簇用全細胞ELISA同樣可以在其它血清型大腸桿菌和產生或不產生Vero毒素的大腸桿菌中檢測到, 而且易受到膽鹽、吖啶黃和溫度的影響,但可以通過結合免疫捕獲的修飾方案來提高ELISA的特異性。
4．免疫熒光技術
DEFT 與Ab-DEFT：
直接熒光技術（DEFT）與抗體定位熒光技術(Ab－DEFT)的主要特點是,顯微鏡下直接計數樣品菌細胞。由於無需培養或分離過程,因此檢測非常快速。DEFT的基本原理為:對樣品進行過濾,用熒光染料(如吖啶橙)對留在濾膜上的菌細胞染色後,用熒光顯微鏡觀察計數。但由於熒光染料的非特異染色,不但被檢菌被染色,本底雜菌也可染色,從而影響了結果的精確性。Ab-DEFT則克服了這一缺點,過濾後的菌細胞與熒游標記的特異抗體作用,然後用熒光顯微鏡觀察計數。
固相熒光毛細管免疫分析
此方法高度敏感，具有快速、試劑用量少、易於操作等優點。Czajlu等用熱殺死的O157: H7菌包被玻璃毛細管作固形支持物。
樣品中加入結合了生物素的O157: H7多克隆抗體,作用一段時間,然後將此樣品/抗體混合物與標記了Cy5 (一種熒光花青染料)的親和素加入到毛細管,孵育2min,沖洗、吹乾,由激光感測器系統發射650nm波長激發光激發花青染料,之後用光學感測器系統測定熒光發射密度。
直接免疫熒光抗體染色
Park等對糞便樣品進行離心後,用免疫熒光抗體對糞便塗片進行標記,可檢測到所有培養法證實的菌株,檢測時間<2h。
5．膠乳凝集
該方法是以膠乳顆粒作載體,以O157: H7特異性抗體致敏,製成特異的膠乳試劑,將標本乳化於玻片或有色燒盤上，滴加膠乳試劑,呈明顯凝集而對照膠乳不凝集時即為陽性。
6．間接血凝分析(IEHA)
該法多用於對LPS、可溶性本體抗原、未加熱抗原的抗體檢測,對檢測H抗原的抗體效果不佳。Morooka等檢測了溶血性尿毒綜合征(HUS)病人血清LPS抗體,雖然甲醛化羊紅細胞(SRBC)有低水平非特異性吸附,但不影響該方法作為一種有效、快速（<3h）的診斷方法。因為感染病人血清的滴度明顯高於非特異性吸附。
7. 全自動抗原抗體檢測系統
VIDAS是一種全自動抗原抗體檢測系統。可直接從感染性疾病患者標本中檢測細菌、病毒、弓形蟲、衣原體和螺旋體等微生物的抗原、抗體或毒素。
基本原理：採用酶聯免疫（夾心法）原理，並在底物中摻入熒光物質，最終產生熒光產物4-甲基-7-羥刀豆素，熒光強弱與標本中被測物濃度相關，經掃描樣本讀數與標准比較計算出標准值，並根據陰性和陽性臨界值判定結果。
8.免疫印記法
目的是檢測大腸桿菌O157: H7感染者血清中的O157脂多糖和溶血素特異性 抗體。基本原理是將提純的脂多糖或溶血素用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離後，通過轉移電泳轉移到硝酸纖維膜上，然後用抗原抗體進行免疫檢測。包括SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳、轉移電泳、免疫檢測三部分。
特點是具有比較高的特異性和敏感性 。
免疫檢測
將封閉好的硝酸纖維素膜按梳子齒的寬度剪成每一個泳道一條，依次編號。
1) 每條加入1毫升用PBS稀釋的病人血清，室溫震盪2小時，同時設陽性對照和陰性對照；
2) 用2.5毫升／條PBST震盪洗滌3次，每次5分鍾；
3) 加入用1毫升用PBS稀釋的II抗，室溫震盪1小時；
4) 用2.5毫升／條PBST震盪洗滌2次，每次5分鍾，再用PBS洗滌一次；
5) 將膜放入12毫升顯色液中顯色，室溫震盪15-30分鍾，至陽性對照出現滿意的藍紫色 ；
6) 將膜放入蒸餾水中終止顯色反應，照相；
7) 當顯色的條帶和溶血素的分子量或0157脂多糖的條譜一致時，結果判斷為陽性。
二．分子生物學檢測
分子生物學的出現，為更快診斷微生物提供了許多分子學工具。 這一新的研究是用基因型而不是表型因子來鑒定特異性病原體。因此其特異性更好。加之 操作程序自動化使得DNA分析在實驗室應用中已成為常規操作。自動化DNA提取儀，聚合酶鏈式反應儀(PCR儀)，DNA序列分析儀，脈沖凝膠電泳儀(用於分離DNA大片段，如完整的染色體) 在疾病診斷中都是很有用的。
1．DNA探針
探針(probe)標記：放射性核素 、非放射性物質標記 。
探針的來源 ：①克隆的基因組DNA探針；②cDNA探針；⑧RNA探針；④寡核苷酸探針。
標本處理：根據標本來源和量的不同而處理不同 。
雜交方法：斑點雜交 、southern印跡 、原位雜交 、Northern印跡 等。
雜交信號檢測 ： (1)測量放射性核素射線脈沖數 (2)放射自顯影 (3)顯色法 (4)發光法。
O157: H7特異噬菌體上的sltⅠ、Ⅱ基因、大質粒溶血素基因及染色體上eae基因等都已製成了可雜交檢測的特異探針。Beutin等曾用VT1(750bp,)、VT2(850bp)、溶血素(3.4kb)等探針進行流行病學調查。Thomas等用地高辛標記的VT2B亞單位基因、VT2C基因探針檢測不同噬菌體型O157: H7菌。Huck等篩選了O157: H7大質粒上限制性片段,發展了一種2.0kb的Sma I片段探針,認為此探針對O157: H7血清型最為特異,可與所有O157: H7試驗菌雜交。
2. PCR技術
聚合酶鏈式反應技術（PCR）是一種選擇性體外擴增DNA或RNA片段的方法。具有特異性強、敏感性高、快速、簡便、可擴增RNA或cDNA、對起始材料質量要求低等優點。
PCR技術擴增體系的基本成分
引物: PCR產物的特異性主要取決於引物鏈的特異性。由於存在同源序列，隨意設計的引物鏈，其PCR產物在電泳分析時可能出現多條鏈，因此在設計引物鏈時應充分考慮引物特異性。引物長度一般為15-30個鹼基,G+C含量為40- 60%,濃度0.1-1umol/L 。
TaqDNA聚合酶：濃度為1-4ul/100ul。TaqDNA聚合酶單位用量增長可能導致非特異DNA擴增 。
模板DNA：應避免混有任何蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制劑及能結合DNA的蛋白酶。DNA摸板的制備方法有加熱法、凍溶法、超聲波粉碎法、鹼變性法、SDS裂解法等多種。
4×dNTPs ： dNTP儲存液pH應為7.0，在反應體系中，4種dNTP的濃度應相同，每種dNTP的濃度以50-200 umol/L為宜。
緩沖液及其他成份：PCR反應體系中，一般採用Tris-HCl緩沖液。適宜的Mg2+濃度為高於dNTP總濃度0.2-2.5 mmol/L。
PCR技術循環參數
PCR擴增是由變性、退火和延伸三個步驟反復循環而實現的。確定正確的循環參數是PCR成功的保證。
循環參數
1．變性溫度和時間
模板DNA和PCR產物的變性不完全，是PCR反應失敗最常見的一個原因,在變性步驟，使溫度達到雙鏈DNA完全分離的變性條件是95 ℃ ，30s。對GC含量高的靶DNA序列，宜用較高的變性溫度。在解鏈溫度下，DNA的變性僅需幾秒。但是，使反應管內達到解鏈溫度需要一定的時間。原則上變性步驟應高溫、短時，即要保證變性充分，又要保持聚合酶在整個反應中的活性。
循環參數
2．引物退火
引物退火的溫度和時間取決於引物的長度、鹼基組成及其在反應體系中的濃度 。對GC含量約50％，長20個鹼基的典型寡核苷酸引物而言，最佳的退火溫度為55 ℃ 。在溫度較高的條件下退火，可提高PCR的特異性。
循環參數
3．引物延伸 ：引物延伸是DNA聚合酶將脫氧單核苷酸逐一地加到引物的3』一OH末端，引物延伸溫度取決於DNA聚合酶的最適溫度。如用TaqDNA聚合酶，一般取70-75 ℃ ，常用72 ℃ 。 延伸步驟的時間則取決於目標序列的長度、濃度和延伸溫度。目標序列越長、濃度越低、延伸溫度越低，則所需的延伸時間越長；反之，目標序列越短、濃度越高、延伸溫度越高，所需的延伸時間則越短 一般而言，每1000個鹼基的序列，延伸時間1分鍾便足夠了。對於擴增100—300個鹼基的短序列片段，可省去延伸溫度這一步驟，而採用快速簡便的變性、退火雙溫循環。這是因為TaqDNA聚合酶即使在退火溫度下仍保持很強的活性，而延伸過程可在退火溫度轉變為變性溫度的過程中完成。
循環參數
擴增產物長度 100bp 500bp 1000bp 2000bp
94℃變性時間（秒） 30 30 60 60
55℃復性時間（秒） 30 30 60 60
72℃延伸時間（秒） 30 38 120 180
一般作25-30個循環即可，進行最後一次循環時間、延伸時間增加5分鍾。
PCR擴增產物的檢測方法
PCR反應混合物經過循環擴增後，所需做的工作就是檢測反應液中是否存在預期擴增產物及產物的特異性。目前已經發展了許多檢測分析PCR擴增產物的方法。包括凝膠電泳、高壓液相色譜、核酸探針雜交、探針捕獲酶免疫分析、酶切圖譜分析、單鏈構型多態性分析、核酸序列分析。
PCR技術類型
免疫PCR技術 原位PCR技術 不對稱PCR技術
巢式PCR技術 反向PCR技術 逆轉錄PCR技術
復合PCR技術 彩色PCR技術 抗原捕獲PCR技術
增敏PCR技術 酶標PCR技術 二溫式PCR技術
錨定PCR技術 定量PCR技術 毛細管PCR技術
多重PCR技術 巢式或套式PCR技術
PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用
(1)簡單PCR： Meng等以eae基因5′末端附近一段688bp DNA片段為基礎設計了一對引物,擴增產物為633bp的DNA片段。其退火溫度為60℃－63℃, 應用煮沸法與基因釋放法,大腸桿菌O157: H7檢出限分別為25與38CFU/ml,檢測時間為3h。
Thomas等用PCR擴增了slt基因片段。引物：
正鏈5′-(TTTACGATAGACTTCTCGAC)-3',
反鏈5′-（CACATATAAATTATTTCGCTC）-3』
其PCR產物由凝膠電泳測定,檢測時間為ld 。
徐建國等根據O157: H7 特有的hlyA、B基因序列設計了PCR引物,產物為338bp。
PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用
（2）多重PCR:由於鑒定O157: H7血清型不能僅僅依靠簡單PCR,近年來國外學者對多重PCR方法在大腸桿菌O157: H7的診斷價值方面進行了研究。Meng等同時擴增了eae 上游基因片段、sitⅠ基因片段、sit Ⅱ基因片段,其長度分別為633、210、484bp。此引物設計可有效區別O157: H7血清型與O55: H7、O55: NM。Fratamico等在一個單一反應中同時擴增了eae基因、slt Ⅰ、Ⅱ的保守序列及60MDa質粒保守序列,其產物分別為1087、227、224、166bp。嚴笠選用針對大腸桿菌O157: H7志賀樣毒素Ⅰ、Ⅱ（SLT－Ⅰ、SLT－Ⅱ）和溶血素（Hly）基因的三對引物,在同一擴增體系中進行PCR,檢測12株不同來源的O157: H7大腸桿菌及其它致病性大腸桿菌及沙門菌、志賀菌15株。結果復合PCR方法較單一PCR方法具有較高的特異性，12株O157: H7取得了穩定、可靠的陽性結果。能迅速、有效地與其它致病性大腸桿菌及沙門氏菌、志賀菌相鑒別。
PCR技術在大腸桿菌O157: H7檢測中的應用
（3）原位PCR: kurokawa等不用培養過程,直接用原位PCR技術結合落射顯微鏡,在單細胞水平快速檢測O157: H7 。
4.23SrRNA在大腸桿菌O157: H7分型、檢測中的應用
傳統的細菌分類方法主要依賴於細菌的形態學、代謝產物、酶活性和表面抗原等特徵。隨著現代分子生物學理論和技術的迅速發展，微生物檢測進入了基因時代，以核糖體核糖核酸序列為基礎的分類方法為微生物的鑒別提供了新的分子生物學方法。如16srRNA、 23srRNA、 16-23srRNA區間序列分析等等，它完全不同於傳統方法，具有快速、簡便、敏感和特異等優點。
23SrRNA基因特徵：
原核生物的核糖體有三種大小（分別為23S、16S、 5S）的rRNA。目前已知23SrRNA基因全長序列的菌種數目已達250種。長度大約為3000pb。對許多細菌的23SrRNA基因序列分析發現，其序列的可變性比16SrRNA基因要明顯，特別是親源關系近的種系。利用這些可變區序列的差異可對相同菌種不同菌株進行分類鑒定。同時對已知23SrRNA基因序列分析也發現，在最初的520pb中有6個保守區域（5-10區域），並發現，這6個保守區域中6區段和10區段最保守，該序列在14個菌種中完全一致。
應用：
檢測臨床感染性疾病的病原菌 首先，將兩條引物設計在保守區，成為通用引物，而在變異區中選擇序列作為特異性探針，先用通用引物作PCR擴增，可篩選出含有病原菌的樣本，再用特異性探針與擴增產物進行雜交，對目的細菌作出鑒定，達到診斷病原體及分型的目的。
鑒定特定細菌種屬 目前認為，已發現的23SrRNA基因的IVSs具有種屬特異性，可利用IVSs（插入序列）進行PCR擴增達到對某一種屬細菌的診斷。
在流行病學方面的應用利用可變區序列的差異可對相同菌種不同菌株進行分析。為流行病提供依據。
除以上介紹的各方法外,常用的有效檢測方法還有脈沖場電泳、隨機擴增多態性DNA指紋分析、細胞毒試驗等,在此不一一贅述。
大腸桿菌O157: H7的檢驗程序
樣品 增菌6小時 磁珠濃縮
可疑菌落 山梨醇麥康凱瓊脂
G染色 生化反應 血清學 毒力基因
大腸桿菌O157: H7實驗室診斷依據
有下列情況之一具有實驗室確診意義：
1) 從腹瀉病患者的糞便標本中分離出大腸桿菌O157: H7 ；
2) 經PCR或DNA雜交試驗證實具有溶血素基因 及志賀樣毒素基因；
3) 腹瀉病患者恢復期血清抗O157LPS IgG抗體呈4倍升高；
4) 具有血性便的腹瀉患者的急性期血清或恢復期血清，蛋白印記試驗證實含有和O157LPS、EHEC溶血素或志賀毒素的特異性抗體．
小結
自從O157: H7被認識以來,對其基因的研究越來越細,已經探明了許多結構與功能基因,對其病因學、病理學及臨床治療方面均有很大促進作用。由於引起感染所需的O157: H7劑量很低,有必要發展一些靈敏度高的方法,用於快速有效地檢測。另外,現已發現存在許多變異株,單用一種方法來檢測往往是不夠的。如發酵山梨醇的變異株用SMAC即不能檢測到;由於許多非EHEC(EPEC、霍亂弧菌、志賀菌等)也可產生SLT,故單純檢測SLT也會產生假陽性結果。因此對一個樣品的檢測需結合使用多種方法才能獲得准確的結果。
第三章 大腸菌群測定
一、大腸菌群檢驗
(一)檢驗方法
(二)培養基
(三)檢驗時應注意事
二、大腸菌群的衛生學意義
大腸菌群是評價食品衛生質量的重要指標之一，目前已被國內外廣泛應用於食品衛生工作中。該菌群主要來源於人及溫血動物糞便，一般多用來作為食品中的糞便污染指標。過去我國在大腸菌群的檢驗方面經驗不多，對該菌群的認識也不夠充分。1974年全國修訂食品衛生細菌檢驗方法座談會和1976年全國食品衛生標准會議建議以大腸菌群作為糞便污染指標菌，並提出進行有關大腸菌群方面的科研工作。為此，我們成立了大腸菌群科研協作組，對犬腸菌群的檢驗方法(包括快速檢驗方法)及其衛生學意義進行了廣泛的科學研究和實踐，取得了一定成績，為制訂大腸菌群檢驗方法提供了科學依據。
在這次修訂l976年版食品衛生檢驗方法的過程中，大腸菌群科研協作組又於1983～1985年對大腸菌群檢驗方法進行了實驗研究，並作了對比觀察，同時對國內常用的大腸菌群快速檢測方法也進行了研討，為這次修訂國家標准食品衛生檢驗方法微生物學部分中的大腸菌群測定提供了科學依據。
大腸菌群不是細菌學上的分類命名，而是根據衛生學方面的要求，提出來的一組與糞便污染有關的細菌，這些細菌在生化及血清學方面並非完全一致。其定義為：系指一群需氧及兼性厭氧、在37℃能分解乳糖產酸產氣的革蘭氏陰性無芽胞桿菌。有些科學工作者又用靛基質、甲基紅、V～P、檸檬酸鹽、硫化氫、明膠、動力和44．5℃乳糖分解等試驗，將這群細菌再分為大腸艾希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷白氏菌和陰溝腸桿菌等。不論分法如何，對大腸菌群的判定，均應以上述定義為基礎。
一、大腸茵群檢驗
(一)檢驗方法
1．乳糖發酵試驗。以無菌操作採取樣品，採取量及稀釋倍數，依據國家或當地衛生標准要求及樣品污染情況而定。將待檢樣品接種於乳糖膽鹽發酵管內，接種量在l m J以上者，用雙料乳糖膽鹽發酵管，lm1及1mI以下者，用單料乳糖膽鹽發酵管。每一稀釋度接種3管，置36±l℃溫箱內，培養24±2小時，如所有乳糖膽鹽發酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性；如有產氣者，則按下列程序進行。
2．分離培養。將產氣的發酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±l℃溫箱內，培養18～24小時，然後取出，觀察菌落形態，並作革蘭氏染色和證實試驗。
3．證實試驗。在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落l～2個進行革蘭氏染色，同時